王初課題組在蛋白質羰基化修飾的标記和組學鑒定中取得新的進展

    當細胞内發生脂質過氧化時，細胞膜、線粒體膜、内質網膜等結構中的多不飽和脂肪酸（PUFA）會發生降解生成脂源性親電小分子（lipid-derived electrophiles，簡稱LDEs ）。這些小分子大多具有α, β-不飽和醛或酮的結構，可以與蛋白的親核性殘基Cys, His和 Lys發生Michael加成反應形成羰基化修飾，從而影響蛋白的結構和活性。到目前為止，羰基化修飾已被報道與神經退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等多種病理條件密切相關，因此羰基化修飾蛋白和位點的鑒定對于理解相關疾病的發生具有重大意義。

    王初課題組的一個重要研究方向是發展化學蛋白質組方法對生理和病理狀态下細胞内蛋白質的羰基化修飾進行選擇性标記和質譜分析 (Curr Opin Chem Biol 2016,30, 37-45)。在2017年，課題組發展了生物正交的羟胺探針，以經典的LDE分子4-羟基壬烯醛（HNE）為模型，結合還原性二甲基化标記技術，實現了對外源的羰基化修飾蛋白和位點進行了直接的大規模捕獲和鑒定 (Redox Biol 2017,12, 712-718)。然而鑒定病理條件下内源性羰基化的修飾蛋白及位點仍是該領域的重大挑戰。為了解決這一難題，王初課題組首次将廣泛應用于oxime ligation中的催化劑苯胺結構引入到活性分子探針中，首先以HNE為模型分子，建立和優化了蛋白羰基化修飾的定量化學蛋白質組方法，實現了對上千個羰基化修飾位點的修飾活性的定量分析。苯胺探針與此前大家常用的酰肼、羟胺類探針相比，肽段的加成物的化學性質十分穩定，可以避免質譜制樣和上機過程中發生碎裂，因此具有更高的靈敏性，非常适合研究信号微弱的内源性羰基化修飾。

    王初課題組選擇了将苯胺探針應用于檢測細胞“鐵死亡”(ferroptosis)過程中蛋白羰基化修飾。鐵死亡是在2012年最新被發現和定義的一種細胞死亡方式，它在細胞形态學、生化特征以及基因水平上都與細胞凋亡、壞死、自噬等傳統的細胞死亡方式具有顯著的差别。鐵死亡有兩個顯著特征：死亡過程依賴鐵元素和細胞内的活性氧物種（ROS）水平升高。目前常用的兩種鐵死亡誘導劑是RSL3和erastin，它們可以通過直接或間接的方式抑制 谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）的活性，從而抑制細胞清除脂質過氧化物的能力，導緻ROS不斷累積，引發細胞死亡。

    王初課題組利用苯胺探針，并結合還原性二甲基化标記策略，鑒定出超過400個在鐵死亡中發生羰基化修飾的蛋白靶标。功能性分析顯示這些蛋白主要定位在内質網、高爾基體、線粒體等富含多不飽和脂肪酸的細胞器中，并且富集到肺癌、腎損傷和HIV等疾病中。作者們進一步利用可切割的富集标簽，成功地在發生鐵死亡的細胞中鑒定到20餘個被不同親電脂質分子進行内源羰基化修飾的位點，并對其中的一個線粒體通道蛋白上的修飾位點進行了生化實驗功能驗證。本工作這是首次對細胞鐵死亡過程中的羰基化修飾靶标蛋白的組學的研究，同時也是第一例被報道的在活細胞内鑒定到内源羰基化修飾位點的化學蛋白質組學研究，這些數據成果為後續深入的研究細胞鐵死亡和氧化應激誘導的退行性疾病機理奠定了堅實基礎。

    本工作近日以長文的形式在Journal of American Chemical Society雜志在線發表，題目為“Quantitative profiling of protein carbonylations in ferroptosis by an aniline-derived probe”，并被選為當周的ACS Editor’s choice作為重點推薦文章。王初特聘研究員為本文通訊作者，第一作者為王初課題組化學學院四年級博士研究生、校長獎學金獲得者陳影同學，王初課題組博士後劉源，本科生藍童等多位同學為本課題的完成提供了幫助，德國慕尼黑Helmholtz研究所的Marcus Conrad教授等也參與了本課題的合作。