陳鵬課題組發展細胞互作的原位捕獲技術

近日，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心陳鵬教授課題組以“Enzyme-Mediated Intercellular Proximity Labeling for Detecting Cell–Cell Interactions”為題在J. Am. Chem. Soc.雜志報道了一種能夠在活體和原位情況下捕獲細胞之間相互作用的技術；美國化學會C&E NEWS于2月12日以“New labeling method can reveal cell-cell interactions”為題進行了專題報道。

不同細胞之間的相互作用和信息傳遞在包括免疫響應、器官發育、神經傳導在内的衆多生命活動中都扮演着關鍵角色。目前，研究細胞互作的方法大都需要已知參與的細胞類型，難以在複雜的活體環境下發現或研究未知的細胞間相互作用。為了解決這一難題，陳鵬課題組借助“定向進化”技術和“鄰近标記”策略，實現了細胞之間動态相互作用的原位捕獲。這一被命名為EXCELL（Enzyme-mediated proximal cell labeling）的技術，通過将作者定向進化得到的分選酶（mgSrtA）展示在待研究的細胞表面，能夠對與其相互作用的細胞進行原位捕獲與鑒定，為研究細胞-細胞相互作用提供了有力的工具。

圖 1  EXCELL方法用于捕獲和鑒定細胞間相互作用

源自金黃色葡萄球菌的分選酶Sortase A （SrtA）能夠催化分選肽（LPETG）和寡聚甘氨酸的共價連接。近期有文獻報道将SrtA用于監測小鼠體内特定受體-配體介導的免疫細胞互作過程1。但是該方法需要将SrtA與寡聚甘氨酸分别融合在相互作用的配體和受體細胞上，因此需要預知相互作用的細胞類型，并對兩類細胞同時進行基因改造，因此無法捕捉未知的細胞間相互作用。為了突破這一瓶頸，陳鵬課題組設想獲得一種針對未知細胞的标記方法。由于細胞表面蛋白中有大約5％含有N端單一甘氨酸，受此啟發，他們希望獲得一種對單個甘氨酸的N端氨基進行标記的分選酶，從而能夠對任意細胞加以标記。為此他們建立了對SrtA進行定向進化的高通量熒光篩選平台，并成功獲得了對單一甘氨酸進行标記的高活性SrtA突變體-mgSrtA，能夠實現對任意細胞類型的有效标記。

作者分别借助親和體-抗原（ZHER與Her2）和配體-受體（CTLA4與B7, CD40L與CD40）的相互作用來驗證該方法的可靠性。實驗證明展示在細胞表面的mgSrtA可借助鄰近效應，将含有 biotin标簽的分選肽biotin-LPETG共價标記在與其相互作用的細胞表面。通過流式細胞術檢測，能夠發現biotin标記信号僅在相互作用細胞上有顯著性增強，由此可成功區分和捕獲發生相互作用的細胞。

圖 2在兩類細胞相互作用模型上應用EXCELL，可實現對互作細胞的有效标記

該方法首次将SrtA改造成高活性且具有更寬泛底物譜的“鄰近标記”酶，并驗證其對細胞相互作用的标記和追蹤。文中指出，EXCELL方法無需将寡聚甘氨酸事先引入到對象細胞表面，因此适用于研究複雜體系中未知細胞類型的相互作用。同時，鑒于SrtA底物分選肽僅含五個氨基酸，并已成功應用于小鼠體内。該标記方法不僅易于監測，在未來還可以與多種下遊分析平台兼容，完成對相互作用細胞的捕獲、富集和測序，從而進一步得出細胞間相互作用在時間、空間、類型等多方面的信息。

近年來，一系列蛋白質鄰近标記技術被開發并應用于蛋白質組學研究, 此次開發的EXCELL技術實現了細胞互作的原位标記與捕獲，将鄰近标記策略從“胞内”拓展至“胞外”空間，将在免疫應答、神經傳導等領域具有廣闊的應用前景。陳鵬教授為該論文的通訊作者，課題組博士畢業生葛韻、陳龍為共同第一作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部和beat365合成與功能生物分子中心的資助。

原文鍊接：

https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/jacs.8b10286

C&E NEWS鍊接：

https://cen.acs.org/biological-chemistry/biochemistry/New-labeling-method-reveal-cell/97/web/2019/02