鄒鵬、陳鵬課題組合作開發出基于“生物正交工程”的遠紅區膜電位探針

作為神經系統信息交流的“通貨”，神經電活動是大腦處理複雜信息的物理基礎。與膜片鉗和微電極陣列記錄等基于電極材料的傳統電生理技術相比，熒光膜電位成像在時空分辨率、測量通量等方面具有明顯的優勢。其中，發射波長在遠紅區（640 nm以上）的熒光探針由于其紅移的光譜具有更強組織穿透能力，而且可适于多通路成像觀測，因而備受研究人員青睐。然而目前可使用的遠紅區膜電位探針在亮度和靈敏度方面存在嚴重缺陷，因此亟需發展适用于記錄神經元動作電位的高性能熒光探針。

2021年4月15日，beat365官方网站鄒鵬課題組與陳鵬課題組共同在Nature Chemistry雜志在線發表了他們最新的研究成果“A far-red hybrid voltage indicator enabled by bioorthogonal engineering of rhodopsin on live neurons”。他們綜合利用生物正交反應和膜蛋白工程化改造策略，開發出一系列具有高靈敏度和成像信噪比的熒光膜電位探針HVI（hybrid voltage indicator）。根據成像光譜需求，HVI的蛋白質骨架可借助生物正交反應搭配不同化學結構的熒光染料，構建出一系列跨越可見光譜的複合型探針。其中，橙紅區探針HVI-Cy3具有最高的靈敏度，能夠以高達90的信噪比成像記錄神經動作電位；遠紅區探針HVI-Cy5具有最紅移的光譜，不僅可與綠色或紅色熒光探針同時使用，實現膜電位與鈣離子、神經遞質等重要生理信号的并行觀測，還能夠與光遺傳學工具聯用，實現全光學神經電生理檢測。

圖1 複合型膜電位探針HVI檢測神經元膜電位概念圖

鄒鵬課題組長期緻力于發展和應用化學探針技術，研究參與神經信号轉導過程的生物大分子、支配神經活動的化學和物理信号。他們率先提出“複合型膜電位探針”的概念，利用化學手段将熒光染料與視紫紅質蛋白相偶聯，利用後者的電緻變色效應實現膜電位成像（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 3949-3953）。陳鵬課題組長期緻力于發展适用于活細胞及活體動物的生物正交反應，并通過遺傳編碼技術，實現了蛋白質的特異标記、激活與調控（Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 129-137）。在最新的研究成果中，兩個課題組合作，将化學反應策略與蛋白質骨架改造相結合，對神經元的膜蛋白進行了原位的“生物正交”工程優化。一方面，鑒于目前大多數生物正交反應難以高效地标記膜蛋白，以及點擊化學反應（銅催化炔基-疊氮環加成反應）對神經元的毒性，他們改用了生物相容性更好、效率更高的逆電子需求狄爾斯-阿爾德反應（IEDDA），将高熒光量子産率的遠紅區染料引入工程改造的視紫紅質蛋白的特異位點。另一方面，他們針對視紫紅質蛋白Ace2中的關鍵質子受體氨基酸殘基進行突變篩選，最終得到了消除穩态光電流且亮度及靈敏度顯著提升的遠紅區複合型探針HVI-Cy5。當神經元膜電勢發生去極化時，質子電化學勢的改變促進視黃醛席夫堿的質子化，從而改變視紫紅質的吸收光譜，最終通過FRET效應影響其偶聯熒光染料的量子産率，導緻熒光信号變化（圖2）。

圖2複合型膜電位探針HVI熒光标記方法示意圖及探針響應細胞膜電位變化原理圖

實驗表明，HVI-Cy5可與光遺傳學工具聯用（圖3）。研究人員用短波長光單向或者雙向調控神經元興奮性，同時在遠紅區熒光通道記錄膜電位變化，擴充了全光學電生理學工具箱（圖3a-c）。該技術相比于傳統的多電極膜片鉗刺激并記錄，技術難度明顯下降。HVI-Cy5還可以與其他熒光探針進行雙色成像，無串擾監測細胞膜電勢及鈣離子、遞質和pH等生理信号（圖3d-f）。多色成像将幫助研究者更好地了解膜電位與其他生理信号動态變化的聯系和差異。

圖3具有深紅熒光光譜的HVI-Cy5可與光遺傳學工具及鈣探針聯用實現全光學電生理檢測

此外，實驗将HVI-Cy5與光遺傳學工具分别表達在不同的大鼠海馬體神經元中，利用膜電位成像評估APV和NBQX兩種藥物對神經元突觸連接的影響，解析了NMDAR和AMPAR兩類谷氨酸受體對突觸信号傳遞的貢獻（圖4）。未來，HVI-Cy5有望用于在體外篩選作用于受體蛋白的激動劑或拮抗劑。

圖4 将HVI-Cy5與光遺傳學工具分别表達在不同神經元中可以研究藥物對神經突觸的作用

總之，本文通過對視紫紅質膜蛋白的“生物正交”工程優化，發展了适用于神經元電信号記錄的遠紅區高性能熒光探針HVI-Cy5，實現多色成像和全光學電生理學應用，期待該探針能夠幫助研究者解讀更加複雜的神經元電生理信号。

beat365官方网站博士研究生劉書彰、林暢，北大-清華生命聯合中心博士畢業生胥永顯（現浙江大學醫學中心博士後）為該論文的共同第一作者。beat365beat365鄒鵬研究員和陳鵬教授為該論文的共同通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、北京分子科學國家研究中心和北大-清華生命科學聯合中心的資助。

原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41557-021-00641-1