王初課題組發展新型定量化學蛋白質組學策略

化學蛋白質組學是注釋蛋白質功能和發現生物活性配體靶标的重要工具。在化學蛋白質組學技術中，最常用的是基于活性的蛋白質分析（Activity-based protein profiling，簡稱ABPP），該方法通過結合活性分子探針标記和串聯質譜分析，實現靶蛋白的鑒定。随着定量組學技術的發展，科學家們将活性分子探針和基于同位素标簽的蛋白質組學方法相結合，開發了一系列定量化學蛋白質組學技術，包括基于一級譜定量的isoTOP（基于同位素的串聯正交蛋白水解）-ABPP技術和rdTOP（基于還原二甲基化的串聯正交蛋白水解）-ABPP技術以及基于二級譜定量的MTRP（多通道活性巯基篩選）技術和SLC（流線型的半胱氨酸）-ABPP技術。然而，這些技術依賴于半随機性的數據依賴型質譜采集模式（Data-dependent acquisition，簡稱DDA），以及成本高昂的同位素定量标簽試劑，限制了化學蛋白質組學技術在多維分析和高通量篩選中的應用。

伴随着高靈敏度、高分辨率、高精度的質譜儀器的快速更新，以及生物信息學對于海量數據處理能力的不斷提高，近些年來興起的基于數據非依賴型采集的質譜采集模式Data-independent acquisition，簡稱DIA）逐漸在蛋白質組學研究領域中嶄露頭角。與傳統的DDA模式不同，DIA模式并不僅限于對高強度的肽段離子進行采集和分析，而是将離子根據質荷比大小劃分成若幹個采集窗口後，對每個窗口中所有肽段進行合并分析，從而可以實現無遺漏、無差異的肽段信息采集，因此，DIA模式具有更好的覆蓋度，重現性以及定量準确性。

近日，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心王初課題組在Journal of the American Chemical Society雜志上發表了題為“Quantitative Chemoproteomic Profiling with Data-Independent Acquisition-based Mass Spectrometry”的研究論文。在這項工作中，作者将DIA模式與ABPP技術相結合，發展了名為DIA-ABPP的無标定量方法。該方法解決了之前定量技術中由DDA模式引起的數據丢失嚴重以及高成本的同位素标簽試劑的使用等問題，是一種覆蓋度高、重現性好以及定量準确的化學蛋白質組學新策略。

在完成方法的建立和優化後，作者首先利用DIA-ABPP對活性代謝物——4-羟基壬烯醛（HNE）修飾半胱氨酸的反應性進行了系統的分析。得到了每個活性半胱氨酸對應的HNE劑量效應曲線以及半數效應濃度（EC50）。除了已知的HNE修飾位點外，本工作還發現神經酰胺-1-磷酸轉移蛋白（CPTP）的C105也是對于HNE高敏感的半胱氨酸位點，這些數據可以為後續内源親電修飾在細胞内的生物機制研究提供更加完整的數據支持。

此外，作者也将新方法用于共價片段小分子庫的篩選。作者構建了24個共價片段分子庫進行分析，發現了563個可靶向的蛋白質。對于單一蛋白而言，新方法可以鑒定到更多的半胱氨酸位點，例如核孔蛋白NUP205，DIA-ABPP方法可以定量16個半胱氨酸，而原來的方法隻能獲得2個半胱氨酸的定量信息。此外，作者也對具有相同結合基團，不同反應基團的片段分子對進行了頭對頭的比較，強調了反應基團對半胱氨酸靶向性的影響。

最後，作者将DIA-ABPP技術應用于生物鐘機制的研究中，發現在所有定量的半胱氨酸中，18.43%的半胱氨酸活性具有晝夜節律特征，其比例遠遠高于蛋白質，且兩者相位的峰值具有明顯的差異。除了氧化還原通路外，作者還發現這些活性具有晝夜節律特征的半胱氨酸富集在代謝通路以及泛素-蛋白酶體系統中，這些數據為生物鐘機制的研究提供了新視角和新線索。

總之，該工作發展了一種無标的定量化學蛋白質組學策略DIA-ABPP，具有重現性好，覆蓋度高，定量準确等優勢。由于ABPP是個基于分子探針設計和生物系統應用的模塊化平台，具有很高的兼容性，該方法可以用于高通量臨床樣品的分析，挖掘蛋白質功能和翻譯後修飾相關的生物标志物，為疾病機理的研究和診斷方法的開發提供技術支持。

該論文的通訊作者為beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心的王初教授，beat3652015級博士生楊帆為第一作者。王初課題組的研究生賈國赓，劉源博士以及前沿交叉學院研究生郭九州等合作者為該工作做出了貢獻。該工作得到了科技部、基金委、北京分子科學國家研究中心、教育部生物有機和分子工程重點實驗室的經費支持。

文章鍊接：

https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.1c11053