雷曉光課題組與合作者在利用酶催化方法實現藥物分子高效合成領域取得重要進展

近日，beat365官方网站，北大-清華生命科學聯合中心雷曉光課題組與中科院微生物研究所/天津工業生物技術研究所高書山課題組、以及中科院天津工業生物技術研究所孫周通課題組合作，以“Tuning an imine reductase for the asymmetric synthesis of azacycloalkylamines by concise structure-guided engineering”為題在Angew. Chem. Int. Ed. 上報道了針對亞胺還原酶（IREDs）的蛋白工程改造和利用該催化酶實現多個藥物分子以及中間體的高效合成。該研究工作為IRED的理性設計和為酶催化技術在工業合成中的應用提供了新的研究策略。

手性胺在藥物、農用化學品和材料中有着廣泛的應用，近40%的藥物含有一個或多個手性胺結構，因此胺的不對稱合成在工業生産中極為重要。還原胺化是合成胺的一類重要的反應，它是在還原劑存在下利用前手性酮或醛與胺直接合成烷基化手性胺的一種方法。傳統的不對稱還原胺化反應不僅需要使用昂貴的過渡金屬和手性配體，還存在着其他競争性的副反應，例如過烷基化以及醛酮還原成醇，這限制了其在工業化生産過程中的應用。

考慮到酶催化具有低成本、高選擇性、高催化效率、綠色無污染和可進化性等方面的明顯優勢，發現和改造可以催化還原胺化反應的亞胺還原酶（IREDs）一直是學術界和工業界的研究熱點之一。然而，天然的IREDs 因催化效率低和穩定性差等問題阻礙了其在工業中應用。傳統上，我們可以通過随機突變和高通量篩選的方式來提高IREDs的催化性質，然而這種方式耗時耗力，帶來的成功充滿偶然性，無法總結出可推廣到其他IREDs理性改造之中的經驗和規律。因此，找到一種快速高效改造IREDs的通用策略對于解決IREDs在工業生産中所面臨的問題至關重要。

研究人員以N-Boc-3-哌啶酮和苄胺為模式底物，對IRED酶庫進行篩選，僅獲得了催化效率非常低（Kcat/Km = 0.001 min-1 mM-1），且立體選擇性（78%, R）很差野生型蛋白IR-G36。為了對目标酶進行理性設計來提高酶的催化效率，作者首先解析了IR-G36的蛋白質結構。基于對IR-G36結構和多重序列保守性分析，作者利用輔因子氫鍵網絡重構策略，顯著提高了催化效率（Kcat/Km = 0.010 min-1 mM-1）和立體選擇性（>99%, R）。随後，作者通過活性口袋氨基酸的單點飽和突變獲得了18個優勢突變，并利用三輪疊代組合突變策略對優勢突變進行組合，獲得了最優突變體M4。相對于野生型而言，M4的催化效率提高了3349倍（Kcat/Km = 3.350 min-1mM-1），同時大幅提高了底物載量并降低了酶的載量。此外，作者還通過理性設計對酶進行了熱穩定性改造，結合蛋白内部氫鍵網絡的重構和“consensus”策略，實現了熱穩定性的顯著提高（Tm值提高16.2 ℃）。最後，作者結合蛋白結構分析、分子對接和分子動力學模拟，解析了最終突變體催化效率、立體選擇性和熱穩定性提高的關鍵因素。

為了擴展亞胺還原酶的應用範圍，研究人員利用突變體M5完成了不同氮雜環酮與多個胺供體的制備級反應，并且展現出優異的催化效率和立體選擇性。同時，作者利用M5的實現了模式底物的百克級生物轉化，在24.9 g/L底物濃度下，轉化率達到97%，時空産率高達35.3 g L-1 d-1。

綜上所述，相比于傳統的随機突變策略，該研究所利用的催化機制導向的蛋白改造策略可以快速找到影響酶學性質的位點，從而大大降低蛋白工程化改造中所需的人力和時間成本。同時，這種研究策略對于其他IREDs的工程化改造也有極大的借鑒意義。因此，本項工作将進一步促進還原胺化酶在工業化生産中的開發和應用。

雷曉光教授，高書山研究員和孫周通研究員為共同通訊作者。高書山課題組張軍博士，beat365分子工程蘇南研究院雷曉光教授團隊特聘研究員廖道紅博士，蘇州青雲瑞晶公司陳榮昌博士為共同第一作者。該工作得到中科院戰略性先導科技專項，國家自然科學基金，國家科技部重點研究發展計劃，中科院創新交叉團隊項目，北京市卓越青年科學家計劃，北京分子科學國家研究中心，北大-清華生命科學聯合中心等多個國家重大科研項目和研究機構的資助。

論文鍊接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202201908