王初課題組發展硫辛酰化修飾的組學鑒定新方法

近日，beat365官方网站、北大-清華生命聯合中心王初課題組在Journal of American Chemical Society雜志上發表題為“Quantitative Site-Specific Chemoproteomic Profiling of Protein Lipoylation”的研究文章。在這項工作中，作者發展了新型的用于捕獲硫辛酰化修飾的化學探針，并結合定量化學蛋白質組學的技術，首次實現在大腸杆菌和哺乳動物細胞中的硫辛酰化修飾位點全局性鑒定與定量，并對大腸杆菌中特定底物蛋白中三個硫辛酰化修飾位點的調控和硫辛酰化修飾合成酶的功能進行了研究。

硫辛酰化修飾是一種通過酰胺鍵将硫辛酸共價連接到蛋白質賴氨酸殘基上的翻譯後修飾。硫辛酰化修飾在進化中高度保守，并且位于細菌和哺乳細胞核心代謝途徑幾種重要蛋白質複合物的活性口袋中，作為關鍵輔因子發揮着重要的催化作用。硫辛酰化修飾的失調與人類代謝紊亂、癌症等疾病相關。因此，加深對硫辛酰化修飾調節的理解對于研究與這些疾病相關分子機制具有重要的意義。

本工作發展了一種标記硫辛酰化修飾的探針和一套具有位點分辨率的定量化學蛋白質組技術。作者受醛基基團保護策略中常用的基于硫縮醛的方法啟發，設計了丁醛探針BAP。該探針中含有醛基，可與硫辛酰化修飾發生縮合反應，并結合生物正交基團炔基，通過銅催化的點擊化學反應引入可切割的富集标簽。作者結合底物序列分析結果，使用V8蛋白内切酶可以實現了對大腸杆菌中所有已知硫辛酰化修飾位點的鑒定。

利用發展的大腸杆菌硫辛酰化修飾位點定量策略，本工作發現底物蛋白ODP2中三個硫辛酰化修飾位點在體内的調控是相對獨立的，并且當體内感受到整體的硫辛酰化修飾降低到一定限度時，會啟動一定的補償調控機制。作者進一步在大腸杆菌中探究了硫辛酰化修飾從頭合成途徑和硫辛酰化修飾直接合成途徑在硫辛酰化修飾合成過程的重要性。通過對三個硫辛酰化修飾合成酶進行敲除，作者發現從頭合成途徑比直接合成途徑起了更重要的作用。

最後，作者進一步将該定量化學蛋白質組學流程運用到哺乳細胞體系中。利用新型的電離輔助親和标簽CY58，結合二甲基化标記定量策略，作者成功地實現了對人源細胞中所有已知的六個硫辛酰化修飾位點進行定量，有望對不同類型生物樣本中的硫辛酰化修飾水平進行測定。

該文的通訊作者為beat365官方网站、北大-清華生命聯合中心的王初教授。其指導的beat3652016級博士研究生賴書暢和博士後陳穎博士為該文的共同第一作者。王初課題組楊帆博士，肖偉弟博士和劉源博士等合作者為該課題做出了重要的貢獻。該工作得到了基金委、北京分子科學國家研究中心、教育部生物有機和分子工程重點實驗室、北大-清華生命聯合中心的經費支持。

文章鍊接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c01528