雷曉光課題組與合作者開發出新一代DYRK2激酶小分子抑制劑并首次揭示了該激酶對蛋白合成及鈣内流的調控作用

近期，beat365官方网站雷曉光教授與beat365生命科學學院肖俊宇研究員、南方科技大學田瑞軍教授在eLife雜志上發表了最新合作研究成果“Selective inhibition reveals the regulatory function of DYRK2 in protein synthesis and calcium entry”。該工作報道了新一代高活性、高選擇性DYRK2激酶小分子抑制劑的開發，以及利用該抑制劑作為工具分子通過化學生物學手段首次揭示了該激酶對蛋白合成及鈣内流的關鍵調控作用。

人體雙特異性酪氨酸-磷酸化調控激酶DYRKs是進化保守的激酶家族，以對其自身的酪氨酸殘基和其他蛋白的絲氨酸/蘇氨酸位點具有激酶活性為主要特點。DYRKs屬于絲氨酸/蘇氨酸CMGC激酶家族，共有五個成員。DYRK2是DYRKs家族的主要成員之一，但其生理功能尚未被完全揭示。近期研究表明雙特異性酪氨酸磷酸化調控激酶2(DYRK2)是一個蛋白酶體調控激酶。抑制DYRK2激酶能夠顯著降低蛋白酶體活性，導緻小鼠異種移植模型中腫瘤細胞周期進展受阻、生長減緩。

在前期研究中，雷曉光、肖俊宇課題組與合作者報道了DYRK2特異性小分子抑制，LDN192960 （PNAS 2019）。晶體結構解析和生化研究揭示了LDN192960 選擇性抑制DYRK2的分子機制。LDN192960能夠通過抑制DYRK2的活性而降低蛋白酶體活性，從而緩解三陰性乳腺癌和多發性骨髓瘤的進展，表明靶向DYRK2有望成為治療這兩種腫瘤的有效方案。雖然LDN192960對于DYRK2有較好的選擇性和抑制性，但是它還可以抑制其他相關激酶，包括Haspin和DYRK3。

為了消除脫靶激酶的影響，該工作通過基于結構的藥物設計，在基于吖啶的核心結構基礎上設計、合成和評估了一系列新型吖啶類似物，并解析了11個新型小分子抑制劑與DYRK2的共晶結構。其中化合物17(C17)表現突出，對DYRK2具有納摩級别的半抑制濃度(IC50)，并對其他468個人體激酶沒有明顯的活性。此外，C17還有效的抑制了細胞中DYRK2的活性。因此，C17是一種高效且極具選擇性的DYRK2抑制劑。

圖1 C17是一個高活性、高選擇性的DYRK2小分子抑制劑

為了發現DYRK2新的生物學功能，該工作将C17作為一個特異而有效的探針，來研究哪些蛋白或信号通路受到DYRK2調控的影響。通過使用無标記的定量磷蛋白組學方法研究了C17處理後細胞磷酸化蛋白組的變化。在此，該研究通過對DYRK2的mRNA含量測序，尋找了一株在内源DYRK2基因高表達的骨髓瘤細胞系(U266)進行磷酸化蛋白質組學分析。結果表明，DYRK2參與複雜的磷酸化網絡，通過直接、間接的作用調節蛋白質的磷酸化狀态。在顯著下調的位點中，該工作重點關注了兩個重要的潛在底物蛋白，真核翻譯起始因子結合蛋白1(4E-BP1)和基質相互作用分子1(STIM1)。

圖2 基于C17的定量磷酸化蛋白質組學分析

4E-BP1是轉錄過程的重要調節因子，已有研究表明是DYRK2的潛在底物。該研究通過建立體外激酶活性體系，驗證了DYRK2可以直接磷酸化4E-BP1上的多個位點（包括質譜鑒定到的位點Thr37），并且C17以劑量依賴性的方式抑制這些位點。此外，4E-BP1受多種激酶的共同調節，進一步研究表明，當C17與AKT、MEK抑制劑聯用時，可以更高效地抑制蛋白磷酸化水平，表現出不同抑制劑之間的協同效應。總之，通過大量的體内外實驗驗證，結果表明4EBP1是DYRK2的直接底物，并揭示了DYRK2 抑制劑與其他激酶抑制劑聯合用于癌症治療的潛在用途。

STIM1是已知的磷酸化蛋白，其磷酸化可以調控鈣庫操縱的鈣内流過程(SOCE)。該研究同樣驗證了DYRK2在蛋白水平、細胞内都可以有效的磷酸化STIM1，這些結果表明STIM1中可能存在多個DYRK2磷酸化位點。據此，該研究進一步通過質譜鑒定到DYRK2作用STIM1的具體位點，包括U266磷酸化蛋白組分析中确定的Ser519和Ser521。為了進一步驗證DYRK2對STIM1的磷酸化修飾的功能，通過Co-IP、FRET體系驗證了DYRK2通過對STIM1的磷酸化修飾增強其與Orai1之間的結合能力，而DYRK2-D275N，STIM1-1-491以及STIM1-10M則不能，且處理C17則可以減弱STIM1和Orai1的相互作用。進一步研究證明，DYRK2磷酸化可以促進STIM1寡聚，增強與Orai1的相互作用，進而誘導SOCE過程。

圖4 DYRK2磷酸化STIM1并參與調控鈣庫操縱的鈣内流過程

該研究結合結構生物學與化學生物學方法，系統研究和開發了一系列新型DYRK2激酶小分子抑制劑。這些研究為靶向DYRK2的藥物開發提供了實驗數據和理論參考，也更加拓展了對DYRK2生物學功能的理解，為其後續研究提供了有力的分子工具。

該工作中，beat365魏田田博士、王珏博士、梁如琪博士以及南方科技大學陳文東博士為該論文的共同第一作者，beat365雷曉光教授和肖俊宇研究員，以及南方科技大學田瑞軍教授為文章的共同通訊作者。北京師範大學博士研究生陳一蘭、beat365博士研究生曾欣、杜逸飛博士、南方科技大學何岸博士、beat365周文靜博士、浙江大學郭行教授、beat365陳曉偉研究員、beat365王初教授以及北京師範大學王友軍教授對該工作提供了幫助。該工作的晶體篩選在beat365鳳凰工程蛋白質平台完成，晶體數據收集在上海同步輻射光源和日本KEK同步輻射光源完成。該工作主要得到國家科技部重點研發計劃-蛋白質機器專項，國家自然科學基金委-“生物大分子動态修飾與化學幹預”重大研究計劃，北京市卓越青年科學家計劃，北京分子科學國家研究中心，北大-清華生命科學聯合中心等科研基金的資助。

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