陳鵬團隊實現活細胞中染色質化學修飾的編碼表達與串聯解析，芝加哥大學何川教授作點評

2023年3月2日，beat365官方网站陳鵬教授研究團隊與生命科學學院季雄教授課題組在《細胞》（ Cell ）雜志發表了題為“Linking chromatin acylation mark-defined proteome and genome in living cells”的研究論文，發展了在活細胞内“關聯解析”蛋白質化學修飾機制與功能的“單位點-多組學”技術-SiTomics，揭示了受染色質酰化修飾介導的豐富的相互作用組學信息，建立了表觀遺傳調控的蛋白質組與基因組“信息關聯”。

1988年，加州大學洛杉矶分校Michael Grunstein教授團隊發現，真核細胞中的核小體不僅僅是供DNA纏繞的結構，它在調節基因表達上還有着重要作用¹。此後，随着表觀遺傳學先驅David Allis教授在1996年對組蛋白尾部修飾酶的突破性發現²和2001年提出的Histone Code假說³，人們對染色質結構與基因轉錄調控之間關系的理解進入了嶄新的一頁。在一系列組蛋白新修飾被鑒定⁴的同時，人們迫切地想知道這些特異性修飾的性質和功能有何異同，又是如何調控基因表達的？例如，越來越多的證據表明，來自環境的代謝物會通過染色質的化學修飾實現基因轉錄調控⁵，但作為表觀遺傳調控的重要分子基礎，人們對很多化學修飾，尤其是位點特異、雙向可逆的動态修飾對基因表達調控的影響尚不清楚，亟需對這些多層次的表觀遺傳信息加以解析和關聯。

論文截圖

傳統的生物學方法往往借助抗體的特異識别來原位研究蛋白質的翻譯後修飾，而化學生物學技術能夠實現活體環境下的高選擇性和時空特異研究，具有獨特的優勢。在這一工作中，作者借助遺傳密碼子拓展策略，發展了一種具有單氨基酸位點分辨率的多組學技術Single-site-resolved multi-omics（SiTomics，圖1）。通過将一系列帶有賴氨酸酰化修飾的“光交聯”非天然氨基酸，以位點特異的方式引入活細胞内的組蛋白當中，原位模拟内源修飾在基因組上的分布，并與蛋白質光交聯和組學鑒定技術、基因組測序技術等相結合，他們系統性地開展了由位點特異的化學修飾介導的染色質相互作用蛋白質組與基因組“關聯鑒定”。利用SiTomics技術，他們首先鑒定出H3K56位點在短鍊脂肪酸代謝物的刺激下會發生顯著的酰化修飾，進而獲得了受H3K56酰化修飾介導的相互作用蛋白質組和基因組，建立了二者之間的直接關聯。他們的工作還揭示了超級增強子（super-enhancer）在細胞“代謝-修飾-基因轉錄”調控軸中發揮的重要作用。

圖1“關聯解析”染色質動态修飾機制與功能的“單位點-多組學”技術-SiTomics（Single-site-resolved multi-omics）。I. Site-Profiling: 單位點修飾的動态變化情況的比較, II. Site-Link:通過遺傳密碼子拓展技術在組蛋白上引入K*acyl，利用光交聯蛋白質組學鑒定單位點修飾的相互作用蛋白質組, III. Site-Seq：通過遺傳密碼子拓展技術在組蛋白上引入Kacyl，結合傳統ChIP-seq技術研究具有修飾的核小體在基因組中所處的位置

“單位點分辨”的動态修飾定量鑒定

組蛋白修飾位點衆多，不同位點對代謝物響應程度的定量比較，會因不同多肽對質譜響應的差異而難以實現。在之前的研究中，人們往往利用同位素标記的代謝物處理細胞并鑒定同位素标記的修飾肽段，但這樣的方法會損失一些動态變化信息，尤其是對修飾量減少或者原有修飾經擦除後重新被修飾的情況，都難以提供豐度信息。利用SILAC技術标記賴氨酸和精氨酸，整合平行比較同樣長度、修飾和電荷數的同一肽段的變化情況，可以更為精準地定量比較修飾的動态變化（Site-Profiling, I）。最終，通過加權分析，作者鑒定出H3K56位點在短鍊脂肪酸（如巴豆酸、β-羟基丁酸）處理下都顯著地發生了相應的酰化修飾。

“非天然氨基酸”可于活細胞中“連接”表觀遺傳信息

如何在活細胞内實現染色質化學修飾的原位模拟？基于遺傳密碼子拓展的非天然氨基酸技術的優點正在于此。天然賴氨酸的光活性類似物-photolysine能夠維持修飾狀态與體内的賴氨酸修飾一緻（圖2），而遺傳密碼子拓展技術的生物“正交性”使得帶有翻譯後修飾的photolysine能夠定點特異地引入組蛋白當中。借助這些“可遺傳編碼”的非天然氨基酸，帶有特異修飾的組蛋白就可以通過其末端的富集标簽，結合“光交聯”蛋白組學技術（Site-Link, II）和傳染色體免疫共沉澱-測序技術（Site-Seq, III），實現其相互作用蛋白質組及在染色體中定位的協同鑒定。

圖2 Photolysine模拟lysine，最小化結構改變，同時便于維持PTM的結構基團穩定

那麼，定點引入翻譯後修飾的組蛋白是否能夠穩定存在并被整合入染色體當中？被整合入染色體中的組蛋白修飾又去了什麼樣的位置？有沒有幹擾細胞内原始的修飾狀态？和内源産生的修飾在基因組的分布又是否一緻？這樣得到的功能性發現又是否與實際狀态一緻呢？為了回答這些問題，作者設計、合成和開發了分别含有6種修飾（Kac, Kpr, Kbu, Kcr, Khib, Kbhb；K*ac, K*pr, K*bu, K*cr, K*hib, K*bhb）或1種對照（PABK與PABK*,通過TCO小分子原位decage出無修飾的K與K*）的共計14個“非天然氨基酸”探針（圖3），均實現了組蛋白H3中相應賴氨酸修飾位點的定點插入。利用一系列表征手段，分别對帶有特異修飾的組蛋白表達、分布位置、插入位點等進行了确證。同時，利用重标氨基酸探針确證了修飾基團在細胞中的穩定存在時間。這些詳實的數據确證了帶有定點翻譯後修飾的組蛋白能夠在活細胞内穩定存在并被有效整合入染色體當中。

圖3 本文所涵蓋和發展的14個“非天然氨基酸”編碼探針

互作蛋白質組與染色質分布的“協同解析”

作者将Site-Link技術應用于H3蛋白的K37, K56和K79等位點（H3K*56ac，H3K*56cr，H3K*56bhb，H3K*56PABK*，H3K*37cr，H3K*79cr），利用對這些帶有光交聯探針的組蛋白進行交聯-富集和質譜鑒定，他們獲得了不同位點/修飾的相互作用蛋白質組信息，發現不同“位點-修飾”組合的确具有獨特的相互作用蛋白質組。

接下來，作者對巴豆酰化修飾進行了細緻的研究（圖4）。與H3K4me3一樣，賴氨酸的巴豆酰化修飾（Kcr）被報道分布于基因組啟動子區域。将SiTomics技術應用于H3K56cr的研究，作者确實捕獲到一系列報道與H3K4me3相互作用的蛋白質，且随機選取H3K4me3在基因組中分布的位點能夠驗證H3K56cr也分布在這些位置。另外，他們發現H3K56cr具有一個非常特異的相互作用蛋白-GLYR1，與H3K56位的其他修飾基本都沒有結合作用。鑒于之前的報道顯示GLYR1分布在基因體（gene body）區域，作者推斷GLYR1可能與巴豆酰化在gene body的相對高豐度分布有關。進一步利用“時間分辨”的光交聯技術，他們發現在H3K56cr表達量穩定後，GLYR1與之的結合會逐步增加，這在一定程度上解釋了H3K56cr是先被整合進入基因組中，再與GLYR1産生相互作用。在得到這些信息之後，作者推斷細胞中可能存在着“正交”的“識别-裝載”系統，能夠協助這些攜帶有翻譯後修飾的組蛋白整合進入染色體的相應位置，從而使這些組蛋白能夠“重現”内源修飾在基因組上的分布，其獲得的組學數據便是染色質化的蛋白質組和基因組學信息。為驗證這一論斷，作者随即對賴氨酸的β-羟基丁酰化修飾（Kbhb）進行了更為系統的研究。

圖4 SiTomics技術“協同解析”受H3K56cr介導的“染色質化（Chromatinized）”相互作用蛋白質組與基因組

β-羟基丁酰化是與“生酮飲食法”（Keto Diet）最為密切的一個化學修飾，但目前對其的研究報道甚少。将Site-Seq技術應用于β-羟基丁酰化，作者發現帶有H3K56bhb修飾的組蛋白并非随機地分布在染色體中，而無修飾的H3K56則相對随機分布。H3K56bhb确實可以增加一些位置的染色體的開放性。進一步的Hi-C測序發現，單位點修飾的H3K56bhb便足以引起染色體三維結構的變化（圖5）。

圖5 H3K56bhb單位點修飾對三維基因組的影響

“單位點-多組學”技術揭示生理情況的染色體調控

在确認了工具對生理狀态的模拟之後，作者接下來将其應用于酮體代謝下的染色體調控研究。他們首先通過免疫熒光發現酮體代謝下的β-羟基丁酰化修飾在細胞核中呈現特異的聚集樣分布，這可能預示着細胞核中獨特的調控作用。那麼，如何快速尋找切入點，發現這樣的生物學表型所對應的調控機制呢？他們所開發的“單位點-多組學”工具此時便有利于開啟這樣的探索。鑒于之前已經發現酮體代謝情況下，H3K56bhb修飾顯著增加，則可利用SiTomics工具研究H3K56bhb的相互作用蛋白，并考察在基因組上是否存在特異分布。

的确，作者發現H3K56bhb與BRD4存在相互作用，同時，H3K56bhb在超級增強子中有顯著分布（圖6），而作為對照的H3K9bhb則幾乎沒有分布。作者因此推測可能酮體代謝情況下的染色體調控有超級增強子的參與。

圖6 Site-Seq 分析H3K56bhb在基因組的特異分布

最後，通過利用Nabhb處理細胞、模拟酮體代謝下細胞内的染色質動态調控情況，作者發現，超級增強子的确發生了顯著變化，而且與H3K56bhb的基因組整合位點相一緻。此外，β-羟基丁酸處理下，受影響的超級增強子附近的基因其Pol II結合增加，而在H3K56bhb引入的細胞中，這些基因附近的Pol II結合也明顯增加。進一步的RNA-seq分析證實這些發生變化的超級增強子可以幫助解釋代謝情況下相關基因的高表達現象，從而在分子水平上實現了“代謝-修飾-調控”軸的貫穿（圖7）。

圖7 SiTomics解析代謝情況下H3K56bhb定點修飾對細胞超級增強子的影響

綜上所述，SiTomics技術為“關聯解析”染色質動态修飾的機制與功能、系統建立和解碼表觀遺傳“關聯信息”提供了多組學研究平台，并可适用于組蛋白之外的蛋白質和酰化修飾之外的化學修飾，為深入開展蛋白質動态修飾的機制研究、開發相應的化學幹預策略提供了強大的工具平台。

陳鵬、季雄、北大-清華生命科學聯合中心畢業生秦芳菲博士是本文的共同通訊作者；秦芳菲和生命科學學院李伯源博士是共同第一作者。文章返修過程正值北京疫情高峰期，多名同學貢獻了自己寶貴的科研時間，展現了團結協作的風貌。

何川教授（HHMI、芝加哥大學）點評：

表觀遺傳研究近年來正在迅猛發展，DNA甲基化、染色質重塑、組蛋白的翻譯後修飾、RNA可逆修飾7等都是表觀遺傳信息的重要載體（https://www.genome.gov/genetics-glossary/Epigenetics）。如何系統性地揭示環境與表型之間由表觀遺傳介導的動态關系，深入研究其分子機理，這就需要各種基因組學、成像和其它有效的方法的結合。表觀遺傳調控本質是生物大分子上化學動态修飾的問題。化學的方法來研究表觀遺傳應該有巨大前景。這篇文章提供了一個非常好的例子。其理論基礎就是過去20多年廣泛發展起來的生物正交反應體系。比如2022年的諾貝爾化學獎頒給了點擊化學與生物正交反應，簡單的炔基與疊氮基團的偶聯反應，與生物體系兼容且正交，為很多生物學新發現提供了有效的工具。此次陳鵬團隊與合作者的這個工作實現了利用遺傳密碼子拓展技術将組蛋白化學修飾定點“編碼”到活細胞的染色質當中。他們系統分析了這些外源引入的化學修飾與生物體系内源修飾的正交性，同時利用光交聯的化學手段研究相互作用蛋白質組，并結合傳統生物學測序技術鑒定基因組信息，展示了這個技術的巨大前景。

1. 在技術發展方面，利用“遺傳密碼子拓展”策略，實現了活細胞内蛋白質翻譯後修飾的“編碼”研究

蛋白質的化學修飾通常都是“翻譯後”事件，目前隻能依賴特異識别某個修飾的抗體加以原位研究，尤其對于不同位點的相同修飾，甚至同一位點上化學結構相近的不同修飾，經常很難加以區分，更無法在活細胞内進行特異、原位的研究。通過使用化學合成的片段體外重組核小體可以對定點的組蛋白修飾開展結構和功能研究，但在活細胞内進行定點修飾研究仍然受限。普林斯頓大學的Tom Muir教授開發的intein技術雖然可以通過多肽/蛋白質的胞外遞送在一定程度上實現活細胞内的研究，但是具有較多的局限性。遺傳密碼子拓展技術能夠将這些帶有修飾的氨基酸以“非天然氨基酸”的形式“編碼”到活細胞的組蛋白當中，能夠實現修飾類型和氨基酸位點的“精準編程”，為表觀遺傳修飾研究提供了廣闊的天地。陳鵬團隊發現修飾的氨基酸可以被“編碼表達”到組蛋白的特定位點，而在染色質整體水平上這些“精準編碼”的組蛋白能夠維持穩定并在生理條件下被有效地整合進染色體當中。基于此，大量的組學數據也展示出染色體上這些結構相近的化學修飾的特異性。這一技術對未來針對特定修飾功能或兩到多種修飾之間協同功能研究提供了一個普适平台。

2. 實現了“單個位點-特定修飾”的染色質相互作用蛋白質組-基因組“串聯解析”

陳鵬與合作者發現組蛋白在單個氨基酸位點上的修飾變化就足以引發三維基因組的變化，為位點特異的組蛋白修飾調控高階3D染色質結構和功能提供了有力的證據，也預示了這個技術的巨大前景。通過将SiTomics技術與ChIP-MS、ChIP-seq聯用，他們以染色體上特定位點的化學修飾為單元，進行了蛋白質組、基因組的多層次“關聯研究”，通過光交聯同時可以在活體細胞裡鑒定各種結合蛋白質，這些在以往的傳統研究中是難以實現的。作者選擇圍繞顯著受代謝影響的H3K56進行了各種功能研究，發現H3K56bhb在增強子上的調控作用，也展示了該技術在生物研究上的應用。

該工作有助于我們去理解受化學修飾調控的蛋白質組和基因組是如何相互影響，并最終影響基因轉錄的。我們希望這樣的化學生物學工具越來越多，同時期待文中所提供的大量數據信息能夠推動更為深入的生物學機制研究。

參考文獻：

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