趙美萍教授課題組在基因突變高靈敏檢測方向取得重要進展

       基因突變的快速準确檢測對臨床治療方案選擇、療效評價、疾病伴随診斷及實現精準醫療等都具有至關重要的意義。然而，由于血液或微量組織樣本中大量共存的DNA野生鍊帶來的背景幹擾，目前廣泛使用的方法在檢測變異等位基因頻率（VAF）低至接近0.01%甚至更低水平的基因突變時，其檢出能力明顯不足。近年來，盡管新的方法不斷湧現，但在可控性、普适性、定量能力、檢測時間和成本等方面仍存在較多的局限性。

　　2023年7月27日，beat365官方网站趙美萍教授課題組在《自然—生物醫學工程》（Nature Biomedical Engineering）在線發表了題為“Detection of low-frequency mutations in clinical samples by increasing mutation abundance via the excision of wild-type sequences”的研究論文。該研究發展了一種具有單堿基區分能力的DNA分子剪切工具，能夠高度特異性地清除基因組DNA（gDNA）和循環遊離DNA（cfDNA）中的高背景野生鍊，從而使突變位點的VAF大幅度提升。這一新穎、高效且通用的方法為基因突變的高靈敏檢測提供了全新的途徑。

　　趙美萍教授課題組一直緻力于研究各種核酸酶與核酸分子之間的相互作用機理。研究團隊在早期的研究中發現，雖然DNA分子的骨架被磷硫酰化修飾後完全抵抗脫氧核糖核酸内切酶I（DNase I）的水解作用，但當一條磷硫酰化修飾的DNA單鍊（sspDNA）與另一條完全互補的正常DNA單鍊雜交後，DNase I仍然可以快速水解該雙鍊中的正常DNA單鍊。通過将sspDNA與DNase I進行預組裝，他們得到的蛋白-sspDNA複合物在對正常DNA進行水解時表現了序列選擇性。對與sspDNA序列完全互補的底物DNA序列可以快速水解，而對存在錯配或完全無關的DNA序列，水解速率顯著下降（Chemical Science 2016, 7, 2051）。

　　研究團隊通過進一步探索sspDNA與DNase I之間的相互作用特點，揭示出sspDNA因骨架上硫原子的荷電能力和疏水性與氧原子的差異，使其與DNase I的親和力明顯高于正常的DNA鍊。基于這一特性，他們巧妙地構建了一種精準的DNA分子剪切工具（sgDNase）。通過競争性結合和水解機制，sgDNase以sspDNA作為惰性模闆鍊，在DNA樣本中實時引導DNase I對野生型DNA鍊（WT）進行特異性水解，而突變鍊（MT）由于存在堿基序列的差異而得以保留（圖1a）。實驗結果表明，sgDNase對sspDNA覆蓋範圍内所有類型的突變均具備單堿基分辨能力（圖1b-d）。

　　圖1. (a) sgDNase對DNA分子進行序列特異性剪切的原理示意圖；(b-d) sgDNase的單堿基區分能力展示：(b)KRAS G12野生鍊和不同突變鍊（KRAS G12 WT/G12A/G12V/G12D）經sgDNase水解所得産物的凝膠電泳圖；(c) BRAF V600 野生鍊和不同突變鍊（BRAF V600 WT/V600E/V600A/V600G）經sgDNase水解所得産物的凝膠電泳圖；(d)EGFR L858R 野生鍊（T1-EGFR WT）和突變鍊（T1-EGFR MT）經sgDNase水解産物的HPLC色譜圖。

　　在sgDNase這一DNA分子剪切工具的作用下，低豐度基因突變的樣本轉變為高豐度基因突變的樣本，而後者可以輕松地通過各種常規突變檢測方法，如Sanger測序法、二代測序法（NGS）、數字液滴PCR法（ddPCR）或熒光探針法等檢出。在圖2a中，經過sgDNase處理後，樣本中EGFR L858R突變的VAF從0.01%提升至22%，通過Sanger測序法即可迅速檢出。将sgDNase體系拓展至18種常見的熱點突變，這些基因突變即使初始VAF低至0.01%，在經過sgDNase處理後，也可通過Sanger測序法（圖2b）或NGS（圖2c）快速檢出。該方法可用于多位點基因突變的同時富集，與NGS聯用，目前可實現至少300個不同位點的同時高靈敏檢出。

　　圖2.(a)sgDNase處理前後，樣本中EGFR L858R突變的VAF變化對比（Sanger測序結果）；(b)18種常見的熱點突變在經過sgDNase處理後VAF的變化對比；(c) sgDNase處理前後，樣本中KRAS G12G13突變的VAF變化對比（NGS測序結果）。

　　圖3. (a)雙sspDNA引導的sgDNase用于基因組DNA中低頻突變的富集。(b) 不同起始VAF的EGFR L858R突變經雙sspDNA引導的sgDNase處理後的VAF測定結果。(c)三個未知樣品經雙sspDNA引導的sgDNase處理後EGFR L858R突變的VAF測定結果。

　　研究團隊進一步設計了成對的sspDNA，用于對基因組雙鍊DNA的直接剪切處理（圖3）。初始VAFs分别為1%～10％、0.1%～1％和<0.1％的三個未知樣品經過雙sspDNA引導的sgDNase處理後，通過Sanger測序測得VAFs分别為39％、17％和8％。測定結果得到了ddPCR法的确證。

　　sgDNase分子剪切工具在臨床樣本的基因突變檢測中展現出了良好的應用效果（圖4）。例如：在用于非小細胞肺癌(NSCLC)和結直腸癌患者的血液樣本和組織樣本中EGFR L858R突變的檢測時，直接測序隻能測出2例組織樣本為陽性，血液樣本都未測到陽性。經過sgDNase處理後，有2例血液樣本和另1例組織樣本被檢出為陽性。這些陽性結果得到了NGS 深度測序結果的确證。對結直腸癌患者的樣本進行KRAS G12/G13 突變檢測時，經過sgDNase處理後，不僅有效提升了在血液樣本中檢出的能力，而且幫助測出KRAS G13D+G13S雙陽性的樣本。在靜脈畸形患者樣本的檢測中，經sgDNase處理後，有多例陽性樣本被檢出。

　　圖4.(a)sgDNase用于8位NSCLC 患者（P1-P8）和4位結直腸癌患者（P9-P12)血液樣本(B)和組織樣本（T）中EGFR L858R突變檢測的結果。(b)sgDNase處理前後部分樣本中EGFR L858R 突變的測序結果。(c)sgDNase處理後癌症患者與陰性對照樣本的VAFs 對比。

　　作為一種新穎的序列特異性DNA分子剪切工具，sgDNase克服了同類方法存在的反應溫度條件苛刻、序列設計複雜、定量能力差、輔助設備/試劑昂貴以及普适性不佳等問題，不僅剪切過程反應溫和、序列通用性好，而且可達到單堿基分辨的水平。sgDNase與Sanger測序法聯用可實現VAF低至0.01% - 0.1%的基因突變的快速低成本篩查；與ddPCR法聯用可實現VAF低至0.1 ppm的基因突變的超靈敏快速定量檢測；與常規測序深度的NGS法聯用可實現多個突變位點的高通量高靈敏多重檢測。sgDNase既可直接用于提升臨床檢驗中腫瘤早篩、複發監測和微小殘留檢測等的檢出能力，也可靈活設計，進一步拓展用于其它基因損傷分析或外源基因的追蹤等，在基因檢測相關領域有廣泛的應用前景。

　　beat365官方网站已畢業博士生陳維（2011本/2015博）、已畢業本科生徐海齊（2016級）和在讀博士生戴沈镔（2017本/2021博）為該工作的共同第一作者，beat365官方网站趙美萍教授、華中科技大學同濟醫學院肖先金教授（2016年博士畢業于北大化學院）和吳曈勃教授（2017年博士畢業于北大化學院）為共同通訊作者。beat365第一醫院皮膚科林志淼教授和首都醫科大學附屬北京兒童醫院（國家兒童醫學中心）張斌博士對研究工作給予了大力支持。該項目得到國家自然科學基金委、北京分子科學國家研究中心的資助與支持。

　　原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41551-023-01072-8