陳知行課題組、鄒鵬課題組合作發展更溫和的遠紅區膜電位探針

      2023年8月17日，beat365生命科學聯合中心的陳知行課題組和鄒鵬課題組在Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.雜志在線發表了最新合作研究成果“Orange/far-red hybrid voltage indicators with reduced phototoxicity enable reliable long-term imaging in neurons and cardiomyocytes”，他們合成了光穩定性良好的環辛四烯（COT）修飾的花菁染料，搭配靈敏度優異的複合型膜電位探針HVI（hybrid voltage indicator），将其升級為新一代低光毒性探針。其中，橙色熒光探針HVI-COT-Cy3 可對神經元進行持續30min的膜電位記錄，還能有效鑒定藥物對神經元和心肌細胞電生理的影響；此外，遠紅色探針HVI-COT-Cy5可與綠色熒光探針聯用，實現神經膜電位與鈣信号連續15 min的并行檢測。

　　揭開大腦奧秘的關鍵在于解析細胞間的通訊機制，特别是神經電活動信号的傳導。相較于傳統膜片鉗技術，利用成像方法記錄細胞膜電位具有高通量、非侵入式等優勢，逐漸在檢測可興奮細胞電信号的時空動态變化方面嶄露頭角。基于電壓敏感蛋白質與小分子熒光染料複合型結構的熒光膜電位探針，在電壓靈敏度、光穩定性和細胞特異性等方面展現出明顯優勢，極大地促進了光學成像在檢測神經活動方面的應用。

　　然而，熒光成像所需的激發光對活細胞存在固有光毒性，而膜電位成像為了獲取足夠高的信噪比，需要更高的激發光強度，相應導緻更明顯的光毒性和更迅速的光漂白，從而大大限制了膜電位成像的記錄時長。對于神經科學研究者和藥物開發者而言，無論是研究突觸可塑性、動物行為節律，抑或是表征藥理毒性，往往需要連續或累積進行長時間的電生理記錄，這極大考驗了膜電位探針的光穩定性和光毒性。

　　鄒鵬課題組長期開發檢測生物信号的化學探針，率先提出“複合型探針”概念（Angew. Chem. Int. Ed.2018, 57, 3949-3953），使用生物正交的化學标記策略将熒光染料與視紫紅質蛋白偶聯，并通過電緻變色效應實現細胞膜電位觀測（Nat. Chem. 2021, 13, 472-479）。然而，他們在實驗中發現基于化學染料的熒光探針很難避免對神經元造成光毒性損傷。陳知行課題組一直緻力于根據化學原理量身定制化學分子，解決生物學研究中“技術卡脖子”問題。2020年，陳知行課題組發表文章（Chem. Sci. 2020, 11, 8506-8516），應用三線态淬滅劑環辛四烯（COT）偶聯策略合成了線粒體探針，首次在活細胞水平上展示了低光毒性探針在超分辨成像領域的潛力。因此兩個課題組一拍即合，針對膜電位成像中光毒性這一痛點展開了聯合攻關。團隊通過合成COT 修飾的花菁染料COT-Cy3和COT-Cy5，開發了更溫和的新型膜電位探針HVI-COT，顯著改善了膜電位成像的光毒性和光穩定性（圖1）。

　　圖1 低光毒性複合型膜電位探針概念圖

　　實驗表明，HVI-COT-Cy3靈敏度（-33.4±0.8% ΔF/F0 per AP）超越HVI-Cy3，創下橙色波段膜電位探針靈敏度的新記錄。憑借優秀的光穩定性和輕微的光毒性，HVI-COT-Cy3可對神經元連續進行30 min 的膜電位記錄，并能在該時間窗口内鑒定多種藥物對神經元動作電位爆發頻率影響（圖2）。值得一提的是，HVI-COT-Cy3的光穩定性是同類探針Voltron2₅₂₅的40多倍，光毒性也明顯降低。

　　圖2 HVI探針熒光标記方法、膜電位響應原理，以及長時間記錄神經元電活動結果

　　此外，HVI-COT-Cy5可搭配綠色熒光鈣探針GCaMP6s，在神經元和心肌細胞中進行連續15 min的雙色成像。多色成像有助于研究者了解多種動态變化的生理信号之間的聯系和差異。未來，HVI-COT-Cy5有望搭配綠色鈣探針，以雙重指标評價藥物的神經或心肌毒性。

　　圖3 利用HVI-COT-Cy5 與GCaMP6s 同步記錄神經元和心肌細胞電-鈣信号

　　綜上，本文通過對化學熒光染料的修飾改性，針對膜電位成像領域的光毒性痛點，發展了更溫和的能夠長時間記錄神經元和心肌細胞電信号的高性能熒光探針，實現了長時程多色成像和藥理學檢測。近年來，功能性膜電位成像應用深度和廣度不斷拓展，朝着更多樣的研究體系、更深層的在體觀測區域、更長的記錄時長邁進。預計HVI-COT系列探針将成為研究者更可靠地評估藥物對神經元或心肌細胞的電生理影響的重要工具。

　　beat365官方网站博士劉書彰，前沿交叉學科研究院、北大-清華生命聯合中心博士生淩靖為該論文的共同第一作者。beat365未來技術學院陳知行研究員和beat365鄒鵬研究員為該論文的共同通訊作者。該工作得到了北京市科委、國家自然科學基金委、科技部、北京分子科學國家研究中心、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、beat365IDG/麥戈文腦科學研究所和北大-清華生命科學聯合中心的資助。

　　原文鍊接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2306950120