鄒鵬課題組報道紅色熒光膜電位探針

　　細胞膜電位的動态變化是神經元編碼信息和相互通信的“語言”。相比傳統基于電極記錄的膜片鉗技術，利用熒光成像方法記錄細胞膜電位具有非侵入式檢測、高測量通量等優勢，逐漸在檢測可興奮細胞電信号的時空動态變化方面嶄露頭角。其中，基于電壓敏感蛋白質的遺傳編碼膜電位探針能夠實現細胞特異性電活動檢測，已在腦成像方面得到廣泛應用。然而目前靈敏度較高的幾類膜電位探針主要發射綠色熒光，而在紅色熒光發射波段的探針靈敏度普遍較低。

　　2023年11月22日，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心、IDG麥戈文腦科學研究所、合成與功能生物分子中心鄒鵬課題組，在《Science Advances》發表題為“Bright and sensitive red voltage indicators for imaging action potentials in brain slices and pancreatic islets”的研究成果。他們基于電緻變色能量共振轉移（electrochromic Fluorescence Resonance Energy Transfer, eFRET）機制，進行了遺傳編碼膜電位探針的理性設計，對微生物視紫紅質及紅色熒光蛋白的融合蛋白進行了工程改造，開發了具備高信噪比的紅色熒光遺傳編碼膜電位探針：Cepheid1b和Cepheid1s。具有紅移光譜的Cepheid1b和Cepheid1s能夠在多通道成像中搭配藍光激活的光遺傳學或熒光工具，對興奮性細胞的生理活動進行多維監測。在小鼠大腦切片和胰島組織中，Cepheid1b的膜電位檢測能力得到了充分驗證。

　　基于eFRET機制的膜電位探針由産生信号的熒光蛋白以及包含生色團且對膜電位敏感的視紫紅質蛋白組成，兩者構成熒光共振能量轉移（FRET）供體-受體對。提高FRET效率對改進膜電位探針表現至關重要，而前者由等供受體距離、光譜重合度、熒光團分子朝向等多方面因素決定。此前的相關嘗試集中在縮短供體-受體距離方面，即減少連接二者的氨基酸殘基數目。鄒鵬課題組依照此前工作積累的經驗，并通過AlphaFold2模型的結構預測發現，将熒光蛋白嵌入視紫紅質的胞外環區不僅可以進一步縮短供受體距離，還顯著改善了FRET供體和受體分子間的相對朝向。根據計算預測結果構建的若幹探針在HEK293T細胞及小鼠原代神經元中得到了測試。最終，以Acetabularia Rhodopsin II為FRET受體骨架，以儲軍課題組開發的mScarlet-I1.4和mRuby4為FRET供體的融合蛋白展現出了最高的膜電位響應靈敏度。依據其分别更高的熒光強度和光穩定性，兩探針被命名為Cepheid1b及Cepheid1s。

　　圖1. Cepheid1b/s探針的設計結構，其膜電位響應能力超過了以往的紅色探針

　　Cepheid1b/s憑借其紅移光譜的特性，能夠與藍色光譜激活的光遺傳學工具聯合使用，由此實現了全光學的電生理刺激與檢測（圖2）。多色成像也擴展了膜電位探針的應用範圍，在Cepheid1b和GCaMP6s共表達的離體神經元内，Cepheid1s清晰指示了細胞内鈣離子信号升高過程中的電生理特征，該種多色成像也在離體胰島細胞内得到了驗證。除了鈣信号伴随的膜電位成像，Cepheid1b也能夠與谷氨酸探針共成像，指示谷氨酸神經遞質調控過程中的電生理變化（圖2）。

　　圖2. Cepheid1b/s與藍光激活的光遺傳學工具，綠色光譜鈣探針、遞質探針多色成像

　　除了細胞水平的表征和應用，Cepheid1b也在急性鼠腦切片、離體胰島組織内進行了成像。對鼠腦急性腦切片進行大視野成像的實驗中，Cepheid1b在能夠捕捉到丘腦内超過20個單個神經元的自發動作電位發放（圖3）。對于胰島這一調節血糖的關鍵組織，Cepheid1b搭配鈣成像，從電生理層面揭示了外液葡萄糖濃度切換狀态下，胰島的興奮性變化呈現出細胞個體的異質性（圖3）。

　　圖3. Cepheid1b在鼠腦急性腦切片和胰島組織内的應用

　　綜上，鄒鵬課題組基于電緻變色能量共振轉移原理和AlphaFold2模型的預測，理性設計出了靈敏度與信噪比提升的紅色熒光遺傳編碼膜電位探針Cepheid1b和Cepheid1s。Cepheid1b/s不僅能夠支持多色成像，也在急性腦切片、胰島組織内表現出了出色的膜電位指示能力。該工作不僅疊代出了更高靈敏度的探針，也擴展了探針的開發思路。近年來，功能性膜電位成像應用深度和廣度不斷拓展，朝着更多樣的研究體系、更深層的在體觀測區域、更長的記錄時長邁進。預計Cepheid1b/s探針将幫助研究者更有效地解析動物行為學背後的神經調控功能，更加準确地評估胰島響應環境的電生理性質。

　　beat365官方网站本科生韓易，beat365生科院PTN項目博士生楊鈞淇，北京腦科學與類腦研究所博士後李源，北大-清華生命聯合中心博士生陳煜為該論文的共同第一作者。楊鈞淇與beat365官方网站鄒鵬研究員為該論文的共同通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、北大-清華生命科學聯合中心、北京分子科學國家研究中心、生物有機與分子工程教育部重點實驗室的資助。