鄒鵬課題組與合作者發展免疫鄰近标記技術高分辨解析神經元軸突起始段蛋白質組

　　大腦神經環路的活動依賴于神經元動作電位的産生和傳播。軸突起始段（Axon Initial Segment，AIS）是一個位于軸突上靠近胞體的亞細胞結構，長度一般在20至60 µm之間，是神經元動作電位起始的地方。AIS結構組分、長度或位置的改變均可以影響神經元的興奮性，其結構的完整性對于神經元極性的建立和維持也至關重要。例如：AIS結構被破壞可導緻神經元軸突獲得樹突特性。已有研究表明，在許多神經系統疾病中存在AIS結構異常現象，包括自閉症、阿爾茨海默病、中風、雙相情感障礙、精神分裂症和肌萎縮側索硬化症等。在小鼠模型中，恢複AIS結構和功能可以幫助改善阿爾茨海默症和天使綜合征的神經缺陷。然而，人們目前對于AIS組分的了解依然有限，這阻礙了在生理和病理情況下我們對AIS結構和功能調控的理解。

　　傳統鑒定AIS組分的方法主要依靠抗體染色或藥理學篩選。這些方法受制于抗體或藥物的特異性和商業化程度，不僅成本較高，而且通量很低。此外，AIS區域由于結構緻密而導緻可溶性差，使用傳統的生物化學方法（如免疫共沉澱）分離其中的蛋白質組分效果不理想。近年來，基于生物素連接酶BioID/ TurboID或過氧化物酶APEX/HRP的鄰近标記方法被建立起來，成為解析亞微米-納米尺度下細胞結構蛋白質組學的重要研究工具。然而，這些方法需要将融合了誘餌蛋白的鄰近标記酶通過轉染或病毒侵染等手段導入到細胞，而這種外源表達方法可能會導緻誘餌蛋白的錯誤定位。例如，BioID技術被用于鑒定體外培養海馬體神經元AIS蛋白質組分，由于誘餌蛋白出現了在AIS以外的錯誤定位，所獲得數據的空間特異性較低。鑒于目前AIS組分研究中面臨的通量低或數據質量差等問題，迫切需要開發一種針對内源誘餌蛋白開展鄰近标記的技術。

　　近日，beat365鄒鵬課題組和貝勒醫學院Matthew N. Rasband課題組合作在Nature Communications上發表了題為“Immunoproximitybiotinylation reveals the axon initial segment proteome”的論文。該研究發展了基于免疫鄰近化學标記的新技術，提供了高空間特異性的神經元AIS蛋白質組數據，并描繪了在神經元發育過程中AIS蛋白質組分的動态變化。該工作鑒定到了新的AIS組分如SCRIB，并利用超分辨熒光成像、生物化學等手段對其定位和蛋白質-蛋白質相互作用進行了詳細的表征。這些研究為闡明AIS結構和功能的調控機制提供了豐富的數據資源。

　　首先，作者建立了針對AIS的免疫鄰近标記技術IPL（immuno-proximity labeling）。利用針對AIS蛋白質組分NF186的抗體，将過氧化物酶HRP靶向至AIS處，實現針對内源蛋白質的靶向，避免了遺傳學操作。進一步，利用HRP在過氧化氫的觸發下催化産生生物素苯酚自由基，以100 nm的擴散半徑對NF186鄰近的蛋白質分子進行共價标記，實現對AIS組分的有效覆蓋。免疫熒光成像和免疫印迹分析均證明了IPL方法具有高空間分辨能力。

　　随後，作者以多個神經元亞細胞結構（包括細胞體、樹突、軸突等）作為空間參照，通過10重TMT肽段标簽并結合定量比率蛋白質組學扣除背景信号和參照信号，最終獲得了高質量AIS蛋白組數據。數據分析表明，捕獲到的1403個蛋白質幾乎涵蓋了所有已報到的AIS分子（圖1），包括胞外基質蛋白、AIS膜蛋白及各種電壓門控離子通道蛋白和細胞骨架相關蛋白等。其中，目前已知的AIS高表達分子AnkG、TRIM46、NFASC、Nav1.2和βIV-spectrin處在數據列表前5的位置。至此，作者獲得了成熟神經元AIS高覆蓋度的蛋白質數據列表。

　　圖1：DIV14神經元軸突起始段AIS蛋白組

　　為探讨AIS發育過程中組分的動态變化，作者選取了AIS發育初期DIV7、成熟期DIV14和完全成熟期DIV21三個時間點，通過IPL策略分别給出了各時期的AIS數據集。對發育過程中AIS潛在核心組分的分析，揭示了AIS組分的動态變化：絕大多數蛋白質随着AIS的發育表達量增加，如AnkG和Nav1.2；而少數蛋白質如參與神經元早期極性建立的TRIM46卻呈現出顯著性降低。至此，作者獲得了神經元發育過程中與AIS生理功能匹配的蛋白質組分動态圖譜。

　　最後，作者以DIV14的蛋白質組學數據作為指導，對排名前三且在AIS中沒有任何研究的蛋白質進行了表征（圖2a）。通過CRISPR/Cas9依賴的HiUGE基因敲入策略對感興趣蛋白質添加内源性标簽。成像結果顯示，這三個蛋白質在AIS處有着不同程度的表達，其中支架蛋白SCRIB在AIS處呈現高度的極化（圖2b和c）。随後作者通過體内外基因标簽敲入策略和抗體标記實驗進一步證實了SCRIB在AIS的極化分布。通過CRISPR/Cas9依賴的基因敲除策略和免疫共沉澱實驗，揭示了SCRIB在AIS的富集受AIS核心組分AnkG的征募，且SCRIB N-端結構域參與了與AnkG的互作。

　　圖2：通過标記内源基因篩選AIS分子

　　綜上，該研究發展了可用于标記神經元亞細胞結構AIS的免疫鄰近标記技術，揭示了AIS在神經元發育過程中的蛋白質組動态變化。該蛋白質組數據有助于指導後續針對AIS組分的研究，對深入理解AIS調控神經元興奮性和引發病理缺陷的機制奠定了基礎。　　

　　beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心、北大IDG/麥戈文腦科學研究所鄒鵬研究員和美國貝勒醫學院神經科學系Matthew N. Rasband教授為該論文的共同通訊作者，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心已出站博士後張偉博士為該論文的第一作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、北京分子科學國家研究中心、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、北京腦科學與類腦研究所、National Institutes of Neurological Disorders and Stroke和Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation的支持。

　　原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-44015-2