Nat Chem|陳鵬/樊新元團隊與合作者開發生物正交“色氨酸脫籠”技術助力上萬潛在蛋白的特異激活

　　因其獨特的結構，色氨酸是蛋白質中介導分子相互作用類型最多、也最“昂貴”的天然氨基酸，其生物合成的“成本”遠超其他天然氨基酸，且隻由UGG一個密碼子編碼。【1】由于色氨酸的獨特性和稀缺性，色氨酸往往出現在蛋白質的關鍵位點，穩定蛋白質結構、調節蛋白質構象、調控蛋白質相互作用、參與分子識别和催化等重要過程。【2-3】如果能夠在活細胞内精準操縱特定色氨酸的功能及相互作用，就有望獲得一種特異激活含色氨酸蛋白質的通用技術。然而目前尚無對色氨酸進行“可逆化學編輯”的相關報道。

　　

　　2024年2月28日，beat365陳鵬/樊新元團隊與浙江大學林世賢團隊合作，在Nature Chemistry雜志在線發表了題為“Genetically encoded bioorthogonal tryptophan decaging in living cells”的研究論文。該研究開發了一種能在活細胞中“籠鎖”和“脫籠解鎖”蛋白質中任意色氨酸功能的通用方法（Trp-CAGE，圖1）。該方法利用基因密碼子擴展技術将“籠鎖”色氨酸（Caged Tryptophan）引入目标蛋白的特定位點，實現其功能的暫時屏蔽；然後，利用新發展的生物正交剪切反應在活細胞中完成可控“脫籠”，實現各類蛋白質家族的精準“激活”和功能解析。通過計算機模型預測，該“色氨酸脫籠”技術可對超過28000個來自不同物種的候選蛋白質進行功能獲得性研究。

　　

　　

　　

　　陳鵬課題組長期緻力于發展适用于活細胞的生物正交反應，在國際上率先提出并發展了生物正交剪切反應【4】，即通過對目标蛋白關鍵殘基的保護-脫保護，實現對其活性的原位關-開”調控（即籠鎖-脫籠，caging-decaging）。這種方法普适性廣，對蛋白結構改動小，可以最大程度還原天然蛋白的活性。在前期的研究工作中，陳鵬課題組将生物正交剪切反應運用于多種氨基酸殘基的脫籠，在活細胞中實現了不同種類酶活性的原位、瞬時激活【5-8】。“色氨酸脫籠”是其課題組在生物正交剪切反應領域的全新突破！

 

　　

　　圖1. 色氨酸“籠鎖-脫籠”（Trp-CAGE）策略的示意圖

　　

　　在研究中，研究人員首先設計了能掩蔽幾乎所有色氨酸相互作用的非天然氨基酸，并發展了與之配套的生物正交剪切反應。研究人員在色氨酸的吲哚氮原子上引入一個額外的π系統（乙烯基），通過共轭效應削弱了吲哚環的π能量，從而同時阻斷了色氨酸的極性相互作用、疏水相互作用和π相互作用（圖2）。此外，研究人員還注意到乙烯基的HOMO軌道能量因共轭作用而上升，使其參與逆電子需求的狄爾斯-阿爾德反應（IEDDA）的活性增強。基于這一發現，研究人員開發了首個針對吲哚類結構的IEDDA-剪切反應。該反應可在PBS溶液中穩定進行，能夠在30分鐘内以大于80%的收率得到脫籠産物。

 

圖2. 非天然氨基酸的設計及生物正交剪切反應的發展

 

　　接下來，研究人員采用了遺傳密碼子擴展策略以位點特異性的方式将“籠鎖”色氨酸（N-乙烯基色氨酸，vyW）引入蛋白質中，并采用了“級聯進化”的策略對嵌合體苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶（chPheRS）加以進化篩選【9】。首先，他們選擇了一種與vyW化學結構相似且隻相差一個碳原子的過渡化合物N-甲基色氨酸（1MW）。通過定向進化篩選，成功獲得了能夠識别1MW的突變體（1MWRS），并建立了1MW和vyW與這些突變體之間的對接模型。基于對接模型的不同，研究人員有針對性地對1MWRS進行了三個關鍵殘基的突變，并最終成功鑒定出一種高效準确識别vyW的氨酰-tRNA合成酶（vyWRS）（圖3）。随後，研究者們利用模型蛋白質在體外以及活細胞中評估了脫籠反應的效率。實驗結果顯示，對于體外純化的模型蛋白質-GFP上的vyW，其脫籠效率可超過>90%，而在活細胞中，使用Renilla Luciferase (RLuc)報告系統評估的脫籠效率達到了54%。

 

　　

　　圖3. 氨酰-tRNA的進化及Trp-CAGE在體外及活細胞中的驗證

　　

　　在此基礎上，研究人員建立了蛋白質激活的通用平台。通過在PDB數據庫中使用新建的算法來搜索含有關鍵色氨酸的蛋白質，發現超過28,000個蛋白質的色氨酸-配體距離在5Å以内。這表明這些蛋白質可以通過色氨酸脫籠技術進行功能研究。色氨酸殘基在蛋白質中的化學相互作用可以歸類為五種主要類型，包括氫鍵作用、疏水相互作用、金屬結合、π-π堆積和陽離子-π相互作用。研究人員針對每種相互作用挑選了示例蛋白，并成功使用Trp-CAGE策略“沉默”和“恢複”了相應的蛋白質功能。Trp-CAGE策略的應用範圍廣泛，可以精确調控多種蛋白質的生理過程，包括别構作用、蛋白質成熟過程、酶活口袋調控，蛋白質-RNA相互作用以及蛋白質-蛋白質相互作用等。該策略适用于各種蛋白質家族，包括熒光蛋白（用于生物标記和顯微鏡研究）、金屬結合蛋白（參與金屬離子的配位和催化反應）、激酶（調控信号傳導通路）、熒光素酶（用于生物發光實驗）、翻譯起始因子（調節蛋白質合成）和翻譯後修飾讀取蛋白（參與蛋白質修飾）等。通過Trp-CAGE策略，這些蛋白質的功能可以被精準的調控和研究（圖4）。

　　

　　

　　圖4. 基于Trp-CAGE策略的通用型蛋白質激活平台

　　

　　研究人員進一步關注了利用Trp-CAGE來調控表觀遺傳“閱讀器”蛋白與組蛋白的相互作用。從PDB數據挖掘中，研究人員分别确定了27個、134個和133個含有賴氨酸單甲基化、雙甲基化和三甲基化的識别結構域中含有關鍵的色氨酸。這些結構域可以識别組蛋白H3上K4、K9、K27和K36位點的賴氨酸甲基化。【10】研究證實，Trp-CAGE策略可以在體外以及活細胞中調控所有選定的閱讀結構域（包括PHD、Chromo、BAH和Tudor結構域）與組蛋白H3上的四個甲基化賴氨酸位點（K4、K9、K27和K36）之間的相互作用（圖5）。

　　

　　

　　圖5. 在活細胞中調控表觀遺傳讀碼蛋白

　　

　　綜上，該工作發展了一種獨特且通用的色氨酸脫籠方法，用于“化學”激活蛋白質特定位點上的色氨酸，以實現相應蛋白質的功能獲得性研究。該研究以共轭化學作為設計思路，使用乙烯基作為保護基團，通過共轭吲哚的π系統成功地阻斷了色氨酸的幾乎所有相互作用類型。這種獨特的保護基團可以通過生物正交剪切反應迅速脫除，實現對活細胞内蛋白質的實時、原位激活。更令人興奮的是，該策略具有廣泛的适用性，可以操縱各種不同類型的蛋白質，包括熒光蛋白、金屬結合蛋白、激酶、熒光素酶、翻譯起始因子和組蛋白翻譯後修飾閱讀蛋白等。根據計算預測，該策略可以在超過28,000個候選蛋白質上進行生物正交激活調控，展示了其巨大的應用潛力。這一突破為探索和理解蛋白質功能提供了全新的工具。

　　

　　beat365陳鵬/樊新元課題組博士後朱玉超、浙江大學林世賢課題組博士後丁文龍為論文的共同第一作者，陳鵬教授、林世賢研究員和樊新元副研究員為論文的共同通訊作者。該研究獲得了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、北京市自然科學基金、北京分子科學國家研究中心、新基石研究員計劃、生物醫學峰基金以及博士後創新人才支持計劃的資助。

　　

　　文章鍊接：

　　https://www.nature.com/articles/s41557-024-01463-7

　　

　　參考文獻：　　

　　1. Barik, S. The Uniqueness of Tryptophan in Biology: Properties, Metabolism, Interactions and Localization in Proteins. Int. J. Mol. Sci.21, 8776, (2020).

　　2. Cuello, L. G. et al. Structural basis for the coupling between activation and inactivation gates in K+ channels. Nature 466, 272-275, (2010).

　　3. Xue, Y. et al. Cu(I) recognition via cation-π and methionine interactions in CusF. Nat. Chem. Biol. 4, 107-109, (2007).

　　4. Li, J. & Chen, P. R. Development and application of bond cleavage reactions in bioorthogonal chemistry. Nat. Chem. Biol. 12, 129-137, (2016)

　　5. Wang, J., Wang, X., Fan, X. & Chen, P. R. Unleashing the Power of Bond Cleavage Chemistry in Living Systems. ACS. Cent. Sci. 7, 929-943, (2021).

　　6. Wang, J. et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature 569, 509-513, (2019)

　　7. Li, J., Jia, S. & Chen, P. R. Diels-Alder reaction-triggered bioorthogonal protein decaging in living cells. Nat. Chem. Biol. 10, 1003-1005, (2014)

　　8. Li, J. et al. Palladium-triggered deprotection chemistry for protein activation in living cells. Nat. Chem. 6, 352-361, (2014).

　　9. Ding, W. et al. Chimeric design of pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs and canonical synthetase/tRNA pairs for genetic code expansion. Nat. Commun.11, 3154, (2020).

　　10. Zhao, H. et al. Manipulating Cation-π Interactions with Genetically Encoded Tryptophan Derivatives. J. Am. Chem. Soc.144, 6742-6748, (2022).