陳鵬/樊新元團隊報道用于原代生物樣品研究的生物正交光催化鄰近标記技術CAT-S

　　細胞的生命活動受到各個亞細胞器（細胞核、線粒體、内質網等）中蛋白質網絡的精細調控，以保證其有條不紊地進行。任一亞細胞區域中蛋白質“零件”的損壞或失調，就有可能“牽一發而動全身”，造成細胞的異常乃至疾病的發生。因此，研究亞細胞區域的蛋白質組，尤其是針對臨床疾病相關的樣品，一直以來是蛋白質組學研究的熱點。近年來，鄰近标記（proximity labeling）技術的發展，突破了傳統亞細胞器分離方法的局限，使得在活細胞中原位研究特定亞細胞蛋白質組成為可能。然而，基于生物催化的鄰近标記技術往往需要對細胞進行基因改造以在胞内引入鄰近标記酶（如APEX，BioID等），使其不适宜在難以基因改造的樣品（尤其是原代細胞、臨床樣品）中運用。如何開發适用于原代活細胞及組織樣品的鄰近标記技術，成為該領域亟需攻克的挑戰。

　　近期，以小分子光催化鄰近标記為代表的化學生物學方法的出現展現出了用于難轉染樣品研究的巨大潛力。如諾獎得主MacMillan課題組聯合默克研究人員開發了基于光催化産生活性卡賓探針的細胞膜蛋白質鄰近标記技術μMap¹，并在此基礎上持續探索這類新型技術的應用範圍²。beat365陳鵬/樊新元團隊基于光催化産生活性亞甲基醌探針開發細胞内線粒體蛋白質鄰近标記技術CAT-Prox³，細胞膜受體靶向的CAT-Ex技術⁴，細胞互作鄰近标記的CAT-Cell⁵等技術。随後在國内外研究者的共同推動下，光催化鄰近标記的研究取得了蓬勃發展,很多創新技術相繼湧現，為蛋白質組學研究提供了全新的化學工具。

　　然而，組織原代、甚至人體臨床等更為複雜樣品的原位标記由于存在技術瓶頸而一直處于空白。2024年3月28日，beat365陳鵬/樊新元團隊在Nature Communications雜志發表了題為Bioorthogonal photocatalytic proximity labeling in primary living samples的研究論文。他們在前期開發的線粒體靶向的光催化鄰近标記技術CAT-Prox的基礎上，通過化學改造開發出新一代具有更高标記活性的硫代亞甲基醌探針，以适應更為複雜的原代組織的生物樣品，從而實現了組織原代、甚至人體臨床樣品的線粒體蛋白質的原位标記（CAT-S技術）⁶。

　　作者首先基于前期的CAT-Prox技術進行系統性優化和升級，特别是針對傳統常用的亞甲基醌（QM）标記探針進行化學改造，通過引入硫原子開發出新一代硫代QM标記基團（thioQM），在體外及活細胞内展現出比傳統氧代QM顯著提升的蛋白質标記效率。之後，在多種細胞系中驗證了該方法對線粒體蛋白質的高效捕捉。通過與蛋白質譜技術的聯用，能夠在80%左右的高特異性水平下，定量鑒定300個以上的線粒體蛋白，描繪活細胞線粒體蛋白質組特征；通過綜合分析在多種細胞系中獲取的數據，進一步發掘并驗證了PTPN1、SLC35A4 uORF及TRABD三個新的線粒體定位蛋白，展現該技術在發現新的線粒體蛋白方面的能力。

　　原代活細胞樣品（尤其是臨床樣品）上的應用一直是鄰近标記領域的難點。對此，研究者通過CAT-S技術實現了對小鼠腎髒、脾髒的解離細胞樣品中線粒體蛋白的鄰近标記捕捉，避免了酶法鄰近标記技術對轉基因動物模型的依賴。據此，研究者定量比較了肥胖誘導II型糖尿病小鼠和健康小鼠中的腎髒線粒體蛋白質組特征，發現一系列在疾病狀态下表達變化的線粒體蛋白。其中，脂代謝相關酶類的變化較為顯著，其中Aldh3a2、Acsm2的下降可能造成了相關脂質代謝物的累積，潛在地促進了糖尿病相關的腎病發展。此外，研究者還證明了CAT-S技術能夠對人血液樣品中原代T細胞進行原位線粒體蛋白标記，展現了在臨床樣品上的應用潛力。

　　綜上，該工作對生物正交光催化标記化學進一步發展，實現了其在動物組織和臨床來源的原代細胞的應用，并進行了原位線粒體蛋白質組解析。其無需基因改造、通用性、光控時空分辨等特點，為原代樣品的亞細胞蛋白質組學研究開辟了新途徑。基于該策略，進一步發展靶向其他亞細胞區域的生物正交标記方法、探究更多疾病相關的組學信息，将是未來值得期待的方向。

　　beat365官方网站樊新元和陳鵬教授為本文的通訊作者，博士後劉子琦與博士研究生郭福虎為本文的共同第一作者。該工作得到來自國家自然科學基金、科技部重點研發計劃、北京市自然科學基金、李革-趙甯生命科學青年研究基金等項目經費的支持。

　　原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-46985-3

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