趙美萍課題組發展分子伴侶核酸探針實現活細胞核内核酸修複蛋白的動态熒光成像

　　細胞核是遺傳物質的主要存儲區和加工、調控中心。基因組DNA受到損傷後，細胞核内随即開啟一系列由多種蛋白參與的協同有序的複雜修複過程。但由于核膜的屏障和細胞内複雜的組成環境，對活細胞的細胞核中内源性核酸修複蛋白的原位動态觀測是一個極具挑戰性的難題。

　　脫嘌呤/脫嘧啶核酸内切酶1（APE1）是一種重要的核酸修複蛋白，在堿基切除修複(BER)途徑中發揮核心作用，同時還是許多轉錄因子的氧化還原激活劑，并參與RNA的加工等。2024年3月30日，beat365官方网站趙美萍課題組在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在線發表了題為“Live-cell imaging of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 in the nucleus and nucleolus using a chaperone@DNA probe”的研究論文。該研究報道了一種全新的由蛋白分子伴侶保駕護航的DNA熒光探針，在确保對APE1具有特異性響應的同時，實現了探針的細胞核靶向，首次對活細胞核内不同區域的APE1進行了動态可視化觀測。

　　研究團隊在前期的研究中發現，将生物素标記的含缺堿基位點的DNA（AP-DNA）通過親和素（AVD）組裝在二氧化矽包覆的磁性納米顆粒表面時，該AP-DNA可以自然抵抗多種核酸酶的酶切，但卻可以被APE1有效地識别和定點切割（Nucleic Acids Res. 2017, 45, e45; J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 16925）。随後的研究表明，生物素标記不僅将AP-DNA探針錨定在親和素分子上，同時還顯著提高了AVD對APE1結合的親和力。基于新發現的APE1-AVD-DNA三元體系兩兩互作的協同效應，研究團隊創建了一種全新的蛋白分子伴侶策略來實現對DNA探針的保護（圖1）。

　　圖1. ACP熒光探針的構建、選擇性和對不同類型細胞的細胞器中APE1的定量測定。

　　研究團隊利用特異性抑制劑、免疫沉澱法和基因敲除細胞系等确證了ACP探針的特異性，對不同類型細胞的細胞質、細胞核、線粒體和外泌體等提取蛋白中的APE1含量進行了定量比較。數據反映出不同細胞間細胞核内APE1的含量差異巨大，而細胞質中的APE1含量差别較小。

　　作者進一步用苯硼酸衍生物共價修飾AVD，制得的探針（PB-ACP）通過輸入蛋白α/β途徑靶向細胞核的能力在多種細胞系中都得到了證實（圖2）。研究揭示出APE1在基因表達活躍和DNA損傷程度較高的常染色質區域活性較高，在核仁區有明顯的分布，而在異染色質區分布相對較少。

　　圖2. 由苯硼酸修飾親和素構建的分子伴侶@DNA熒光探針(PB-ACP)及其在不同類型活細胞的細胞核内對内源APE1的熒光響應。

　　APE1在細胞内不同的區域中發揮着不同的作用，其在細胞核中的分布和動态遷移與其執行多種功能密切相關。作者進一步展示了細胞在受到不同類型刺激時APE1活性和分布的變化（圖3）。

　　圖3. 在不同條件刺激下活細胞内APE1活性和分布的變化

　　該研究為在活細胞水平全面理解核酸損傷修複的動态過程和分子機理提供了新穎、高效的分子工具，對深入研究細胞衰老機制、腫瘤等疾病的發生發展和針對性治療等有積極的推動作用。研究提出的分子伴侶協助核酸探針策略也為未來進一步開發更加智能化的核酸探針開拓了一種全新的模式。

　　beat365官方网站已畢業博士生曹翔劍、在讀博士生鄭菁卉和張芮蘭為該論文的共同第一作者，beat365官方网站趙美萍教授為通訊作者。beat365分析測試中心（PKUAIC）的關妍老師和周文老師分别對熒光成像和質譜分析提供了很大幫助。該研究得到國家自然科學基金委和北京分子科學國家研究中心的資助與支持。

　　原文鍊接：

　　https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae202/7637892