2020年4月27日，beat365官方网站賈桂芳該課題組在Nature子刊《Nature Chemical Biology》在線發表了題為“Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection of N6-methyladenosin”的研究論文，首次報道了利用FTO酶輔助實現了RNA修飾m6A的化學标記，并成功應用于全轉錄組m6A的高通量測序。

随着首個RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發現，RNA表觀遺傳學/表觀轉錄組學開始興起并成為表觀遺傳學新的研究熱點。m6A作為首個被發現的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結合蛋白發揮調控功能。已發現m6A具有調控mRNA剪接、出核、穩定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發育、配子發生、細胞重編程、生物節律、疾病等多種生理和病理過程的功能調控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發m6A高通量測序技術一直是研究的熱點。

現有m6A測序技術主要依賴于m6A抗體富集技術，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯用iCLIP或PAR-CLIP技術的高分辨率m6A測序技術miCLIP 或PA-m6A-seq。抗體存在對特定RNA序列或結構的潛在非特異性結合，為了解決抗體方法的種種問題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發了兩類無需抗體的m6A測序技術，一類為利用對特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸内切酶MazF輔助的測序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法隻能檢測16~25%的m6A位點；另一種是在細胞内表達融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實現的m6A測序（DART-seq），但該方法依賴于細胞轉染效率且受限于體外樣品的使用。

賈桂芳課題組一直緻力于開發和利用核酸化學生物學技術研究RNA化學修飾在動植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，将mRNA上化學惰性的m6A轉化為高反應活性的中間态産物N6-羟甲基腺嘌呤（hm6A），然後利用二硫蘇糖醇（DTT）的巯基與hm6A發生亞胺1,2加成反應，将不穩定的hm6A轉化為更穩定的巯基加成産物dm6A。dm6A上的自由巯基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應，實現在mRNA上m6A的位置标記生物素Biotin，最終可被鍊黴親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供後續高通量測序使用。此方法被命名為m6A-SEAL（FTO-assisted m6A selective chemical labeling method）（見圖一）。

圖一. m6A-SEAL測序流程圖

他們将m6A-SEAL分别應用于人HEK293T細胞和水稻的polyA+ RNA上，實現全轉錄組m6A位點檢測。通過該課題組之前開發的基于qPCR的m6A單位點檢測方法SELECT驗證了多個m6A位點，證明m6A-SEAL作為化學共價交聯技術，要比基于抗體的方法或DART-seq具有更高的可靠性和靈敏度。

FTO除m6A外，還對RNA5’帽位置的N6,2'-O-二甲基腺嘌呤 (cap m6Am）具有催化活性，能将其催化為hm6Am。為了驗證m6A-SEAL測序方法是否還會同時檢測cap m6Am，他們通過體外酶活性實驗和标記實驗發現目前m6A-SEAL方法中使用的FTO氧化反應條件隻能特異性将m6A反應成hm6A，通過優化FTO氧化反應條件可以實現m6A-SEAL隻針對cap m6Am的标記和測序。

 總之，該項研究首次利用FTO酶輔助實現了RNA修飾m6A化學标記和高通量測序。m6A-SEAL具有高靈敏度和高特異性的特點，可以應用于少量mRNA樣品。未來他們将繼續對m6A-SEAL進行優化和改造，以實現單堿基分辨率。由于FTO可以氧化催化RNA的cap m6Am和DNA的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA），未來m6A-SEAL通過優化有望應用于這些化學修飾的測序；同時該方法除了可以在m6A上标記biotin用于富集，還可以标記熒光素，有潛力應用于m6A的成像。

賈桂芳實驗室已畢業的博士研究生王烨為論文的第一作者，已畢業的博士研究生肖雨、博士後喻瓊和本科生董舜卿為共同作者，賈桂芳研究員為通訊作者。該研究工作得到了國家自然科學基金、科技部重點研發計劃、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、北京分子科學國家研究中心及上海藥物所新藥研究國家重點實驗室開放課題等經費的支持。

原文鍊接： https://www.nature.com/articles/s41589-020-0525-x