受限于核糖體的線性模闆合成機制，化學拓撲在蛋白質工程中一直是相對被忽視的話題。随着研究的不斷深入，人們發現了越來越多具有非線性結構的天然拓撲蛋白質。它們通常具有與其拓撲結構相對應的功能優勢，在生命活動中行使着重要的角色，發揮着不可或缺的作用。這引起業内對蛋白質拓撲結構調控的廣泛興趣。近年來，發展拓撲蛋白質的制備方法，并探究其結構性能關系和相關應用，已經成為蛋白質工程的熱門方向。

北京大學張文彬課題組近期在拓撲蛋白質的合成和表征方面取得重要進展。他們通過模拟天然拓撲蛋白質合成中的多步翻譯後修飾過程，基于合理的基因序列設計，結合原位組裝、鍊斷裂和正交的定點環化反應，發展了一種高效的蛋白質異質索烴的生物合成方法，不需要額外的胞外反應過程，通過直接表達、純化即可制備蛋白質異質索烴。該方法主要利用p53dim結構域(X)的分子内二聚來引導同一基因片段中兩種目标蛋白質之間的異質二聚，通過共表達蛋白酶進行原位酶切斷鍊，同時利用可基因編碼的蛋白質定點偶聯反應來實現環化合成蛋白質異質索烴。例如，他們利用諜标簽(A)-諜捕手(B)反應對來實現側鍊偶聯環化，通過原位酶切激活分離型内含肽(IntC1/IntN1)介導的主鍊偶聯環化反應，構建了具有支化結構的蛋白質異質索烴，并容許通過基因工程的手段模塊化地融合各種目标蛋白質（圖1）。

圖1. 通過原位酶切、諜标簽-諜捕手反應對和分離型内含肽共同介導（支化）蛋白質異質索烴的生物合成

為進一步簡化合成過程，他們基于分離型内含肽在反應時會自身從主鍊上切除下來的特性，設計了由兩種正交的分離型内含肽介導的環化過程，其可以在胞内次序發生反式剪接和自發鍊斷裂，從而消除了原位酶切反應的必要性，并可實現兩個蛋白質結構域的主鍊環化，制備結構更加簡潔的蛋白質異質索烴（圖2）。X射線單晶衍射實驗成功解析了利用該方法制備的cat-GFPX-X的晶體結構，有力地證明了其中兩個環狀組分之間機械互鎖的空間關系（圖3）。這也是第一個人工設計合成的蛋白質異質索烴的晶體結構。

圖2. 由兩種正交的分離型内含肽介導蛋白質異質索烴的生物合成

圖3. (a)利用X射線衍射解析所得cat-GFPX-X晶體結構(PDB ID: 7BWN)；(b) cat-GFPX-X晶體結構中兩個p53dim結構域的相互作用界面分析

該方法的優勢在于其可基因編碼，高度模塊化，且合成過程無需額外控制，在細胞内直接自發完成，既大大簡化了合成步驟，又有效提高了産物的純度。它适用于胞内合成含有多種功能蛋白質的異質索烴，并可拓展到各種具有支化結構的異質索烴。相較于同質索烴，它們的分子結構複雜性和多樣性進一步提高，有望更好地實現不同結構域之間的協同，深入地探讨拓撲結構對分子性質和功能的影響，在工業酶工程和生物醫藥領域具有廣泛的潛在應用價值。

該研究近期在線發表于Angew. Chem. Int. Ed.，beat365官方网站博士生劉雅傑、方晶和生命科學學院博士生段澤林為該論文共同第一作者。beat365官方网站博士生張凡也為本工作做出了貢獻。beat365beat365張文彬教授和生命科學學院肖俊宇研究員為共同通訊作者。該工作得到國家自然科學基金、科技部、北京分子科學國家研究中心創新項目和beat365臨床醫學+X青年專項項目的支持。

原文鍊接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202005490