作為一種生活中的常見緻癌物，甲醛會對人體産生很大的危害。但另一方面，生物體本身也産生一定量的甲醛。這些“内源”甲醛分子是多條生理代謝途徑的原料或産物，與細胞的存活與生長密切相關。有研究顯示，作為一碳化合物，甲醛能夠被納入一碳循環（one-carbon-cycle），用于DNA與必需氨基酸的合成（Burgos-Barragan, G. et al. Nature, 2017, 548, 549–554）。雖然甲醛的這些生理功能逐漸被揭示，與甲醛相關的許多疑問仍有待探索。例如，細胞是通過何種機制來特異識别和感知内源甲醛的濃度？甲醛對應的信号是如何在細胞内傳遞，産生響應，并避免甲醛造成的損傷？我們又能否對細胞内的甲醛動态分布進行精準探測，以揭示甲醛的生理功能呢？

針對上述問題，beat365beat365、北大-清華生命科學聯合中心陳鵬課題組着手對一個獨特的甲醛響應的轉錄因子HxlR進行了深入研究，首次從結構與化學機理上揭示了甲醛誘導HxlR蛋白發生分子内交聯反應，所産生的“亞甲基橋”（methylene bridge）這一特殊化學修飾使HxlR産生功能獲得性（gain-of-function）生理響應。基于這一發現，他們開發了首個可遺傳編碼的甲醛熒光探針（FAsor），成功應用于檢測活細胞以及小鼠腦組織切片中甲醛的動态變化。相關成果于2021年1月25日在線發表在《自然-通訊》雜志（Nature Communications），“Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction” （DOI：10.1038/s41467-020-20754-4）。

甲醛對于生物學和化學領域的研究者來說并不陌生。如果思考這樣一個問題，甲醛與蛋白質會發生什麼化學反應？答案可能是，甲醛能夠與蛋白質上的親核性氨基酸側鍊發生加成反應；甲醛作為蛋白質交聯試劑，能夠在蛋白質的親核性殘基（如賴氨酸）之間形成交聯，使蛋白質變性失活。然而，甲醛使蛋白質變性的原因不能與細胞響應甲醛的機制劃等号。首先，使蛋白質變性的甲醛濃度遠高于細胞内源甲醛的濃度範圍；其次，甲醛使蛋白質變性是一種非特異性的、損傷性的過程，這很難作為細胞精确響應和調控生理水平甲醛的工作機制。因此，甲醛在細胞中有哪些特異性的響應模式，這些響應是通過什麼樣的分子機制實現的，仍是一個未知的問題。在枯草芽孢杆菌發現的HxlR蛋白是一種轉錄激活因子，能夠在甲醛刺激下激活下遊基因轉錄，進行功能獲得性（gain-of-function）的生理響應（Yurimoto, H. et al. Mol. Microbiol., 2005, 57, 511–519）。受HxlR這一特性的吸引，研究團隊選擇HxlR蛋白以探究其“特異”響應甲醛分子的機制。

首先，為了确認HxlR蛋白直接與甲醛發生了化學反應，研究團隊結合質譜分析與X射線晶體學研究了HxlR與甲醛的相互作用。HxlR與甲醛共孵育後的質譜分析顯示，甲醛能夠使HxlR發生+12 Da的分子量偏移。這一變化與甲醛誘導的亞甲基橋連一緻，說明HxlR很有可能直接與甲醛發生了反應。進一步的二級質譜肽段鑒定，以及HxlR-甲醛共晶結構解析共同佐證了這一點。兩者的結果均顯示，與甲醛反應之後，位于HxlR蛋白N端第一個α螺旋的半胱氨酸（Cys11）與賴氨酸（Lys13）殘基之間形成了位點特異的“亞甲基橋”。針對這一發現，研究團隊又通過位點突變來确認該交聯反應與HxlR蛋白功能的聯系。結果顯示，無論突變哪一個位點（C11A或K13A），HxlR都将失去響應甲醛的能力。這說明HxlR蛋白的确通過Cys11和Lys13特異性識别甲醛，形成亞甲基橋這一獨特的化學修飾，實現轉錄功能的激活。

甲醛與HxlR蛋白位點特異性反應形成分子内“亞甲基橋”

那麼甲醛誘導的分子内交聯又是如何實現對HxlR蛋白功能的激活？研究團隊接下來仔細分析了不同處理條件與突變體的HxlR蛋白晶體結構。通過對甲醛處理前後的HxlR結構對比，他們發現看似簡單的亞甲基橋卻引起了蛋白整體構象的極大變化！甲醛誘導的Cys11-Lys13亞甲基橋迫使原本位于同一α螺旋兩側的兩個氨基酸側鍊相互靠近，扭曲了α螺旋結構，并“牽一發而動全身”，帶動HxlR蛋白N端主鍊朝向翻轉（N-terminal flipping），使得蛋白整體構象發生改變，極大地增強HxlR蛋白與DNA的結合能力，激活下遊基因的轉錄。至此，研究團隊揭示了HxlR特異性響應甲醛并發生結構與功能轉換的分子機制。

甲醛通過位點特異的亞甲基橋連激活轉錄因子HxlR

這一甲醛響應機制的解析進一步為研究團隊提供了啟示：HxlR特異性響應甲醛的構象變化可以用于設計甲醛檢測的熒光探針。目前已報道的甲醛探針均為小分子探針，時空分辨率與細胞、組織特異性受到限制，難以對甲醛的細胞内分布進行精确檢測。基因編碼的熒光探針，在時空分辨的檢測、動态檢測等方面都更有優勢，但鑒于甲醛響應機制研究的缺乏，難以設計基于蛋白質的探針。而HxlR蛋白相應甲醛的分子機制的解析無疑為這一問題提供了解決方案。

基于對HxlR蛋白的結構分析，研究團隊向HxlR特定位點嵌入了對結構變化敏感的熒光蛋白，并通過篩選和優化，成功開發出一系列新型基因編碼的甲醛熒光探針。他們首先在體外實驗中對探針進行了表征。之後，研究團隊利用該探針，成功進行了細胞内甲醛濃度的動态檢測；通過多色熒光成像，對不同亞細胞空間下甲醛變化進行了同步檢測；通過幹擾甲醛代謝通路，記錄了探針對胞内甲醛生理濃度變化的響應。進一步，研究團隊與beat365李毓龍課題組合作，檢測了該探針在小鼠腦組織切片中對甲醛的動态響應，驗證了該探針具有動物組織水平的應用潛力。

基于甲醛響應轉錄因子HxlR蛋白的新型甲醛探針

 綜上，該工作實現了對“甲醛響應”蛋白HxlR的機制解析，發現了甲醛誘導HxlR産生獨特化學修飾，并由該亞甲基橋引起構象變化和激活轉錄調控的分子機制。受此啟發，研究團隊進一步開發了首個遺傳編碼的甲醛探針，為研究細胞内源甲醛的調控與功能提供了重要工具。

需要指出的是，本研究發現的“分子内交聯”這一獨特的化學修飾，可能與蛋白酰基化、烷基化等翻譯後修飾類似，能夠調控蛋白質的活性與功能。例如近期有研究顯示，糖酵解通路的中間産物丙酮醛，可以對細胞氧化應激通路蛋白KEAP1進行“分子内交聯”修飾，在鄰近的精氨酸（Arg）與半胱氨酸（Cys）之間産生交聯，啟動下遊應激響應（Bollong, M. et al. Nature, 2018, 562, 600–604）。可以預見,“分子内交聯”修飾的種類、性質與功能，值得進一步探索。

 陳鵬課題組2012級博士畢業生祝融峰、張功為共同第一作者；beat365生命科學學院、生命科學聯合中心李毓龍教授及其課題組2012級博士畢業生井淼完成了動物實驗關鍵數據。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、北京分子科學國家研究中心以及北大-清華生命科學聯合中心的資助。

論文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-20754-4