蛋白質磷酸化是最重要的翻譯後修飾之一，在細胞信号轉導、分化增殖、應激響應等生命過程中都扮演着極為重要的角色，更直接影響了包括腫瘤在内等諸多疾病的發生發展過程。在過去的幾十年中，得益于質譜技術的飛速發展，磷酸化蛋白質組學技術日趨完善，并在生命科學和醫學領域得到了廣泛的應用【1】。

衆所周知，真核細胞在結構上呈現高度區室化的特征，其中生物大分子的空間分布具有很強的異質性。精準解讀不同細胞器和亞細胞區域的蛋白質磷酸譜，能夠極大的促進我們對于磷酸化功能的認知【2】。然而，現有的磷酸化蛋白質組技術并不具備亞細胞水平的空間分辨率，難以實現對亞細胞區域磷酸化蛋白質譜的深度繪制。

近日，beat365官方网站陳鵬課題組與鄒鵬課題組在PNAS上合作發表題為“Spatiotemporally resolved subcellular phosphoproteomics”的論文，利用生物正交剪切反應和化學脫籠策略，構建了可控激活的鄰近标記酶，并進一步與磷酸化富集技術相偶聯，開發了首個基于生物正交鄰近标記的亞細胞磷酸化蛋白質組捕獲技術——SubMAPP（Subcellular-specific uncaging-assisted biotinylation and MApping of PhosphoProteome），成功實現了活細胞中亞微米分辨率下的磷酸化蛋白質組捕獲，并将其拓展至神經元及活體動物等複雜體系。

近年來，以過氧化物酶（APEX/HRP）和生物素連接酶（TurboID/BioID）為代表的鄰近标記酶，因其優異的空間分辨率和普适性，在空間蛋白質組學領域受到了廣泛關注【3】。然而，現有方法局限于表征蛋白質的豐度，無法進行亞細胞水平的翻譯後修飾組學研究，因而不能體現出蛋白質翻譯後修飾可逆和動态的特性。例如，APEX和HRP需要高達1 mM的過氧化氫誘發标記反應，而Turbo在細胞中的表達會造成大規模的蛋白質生物素化，這些都會在一定程度上影響蛋白質的翻譯後修飾譜【4,5】。因此，迫切需要一種生物正交、時空可控的化學标記工具，用于開展亞細胞水平的蛋白質翻譯後修飾組學研究。

受此啟發，陳鵬課題組基于在蛋白質生物正交激活領域的前期積累【6】，與鄒鵬課題組合作，利用遺傳密碼子拓展技術實現了最新一代生物素連接酶Turbo的光控激活（photoTurbo）和化學激活（chemoTurbo）。通過對酶活性的直接調控，而非生物素的補充來控制其對鄰近蛋白質的标記，生物正交激活Turbo顯著降低了野生型Turbo利用内源生物素标記的背景，消除了内源蛋白質過度生物素化，以及生物素剝奪對蛋白質翻譯後修飾産生的幹擾。同時，在亞細胞蛋白質組的特異性和覆蓋率上，生物正交激活Turbo也毫不遜色于野生型Turbo。

圖1. SubMAPP工作流程

在此基礎上，作者進一步發展了“串聯富集”的策略，将鄰近标記酶介導的空間蛋白質組學技術與特定蛋白質翻譯後修飾富集技術有效整合，實現了亞細胞區域特定翻譯後修飾蛋白質組的深度捕獲。他們成功富集了活細胞内質網腔中的磷酸化蛋白質組，确定了分泌途徑中主要的磷酸化氨基酸殘基序列為S-P-E，并鑒定到了部分已知分泌相關激酶FAM20C的底物和新的磷酸化修飾蛋白/位點。随後，作者應用該技術解析了在内質網應激條件下，腔内蛋白質組和磷酸化蛋白質組的動态變化。有趣的是，通過設計的“脈沖-追蹤”實驗，他們揭示了内質網應激條件下内質網-線粒體之間的“蛋白質穿梭”現象。最後，作者還将SubMAPP技術拓展到了體外培養的大鼠神經元和活體小鼠水平，進一步展示了該技術的高效性和普适性。

綜上，該項研究構建了一種生物正交、時空可控的鄰近标記酶，并結合磷酸化串聯富集策略，發展了亞細胞磷酸化蛋白質組學新技術。未來，該策略有望拓展至其他翻譯後修飾類型，在亞細胞水平繪制多種蛋白質翻譯後修飾譜。

beat365官方网站博士後劉衍軍、博士研究生曾如馨為該論文的共同第一作者，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心陳鵬教授和鄒鵬研究員為該論文的共同通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、北京分子科學國家研究中心以及北大-清華生命科學聯合中心的資助。

原文鍊接：https://doi.org/10.1073/pnas.2025299118

1. Humphrey, S., Azimifar, S. & Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nat. Biotechnol., 33, 990–995 (2015)

2. Altelaar, A. F. M., Munoz, J. & Heck, A. J. R. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat. Rev. Genet., 14, 35-48 (2013).

3. Zhou, Y., Zou, P. The evolving capabilities of enzyme-mediated proximity labeling. Curr. Opin. Chem. Biol., 60, 30-38 (2021).

4. Vepa, S. et al. Hydrogen peroxide stimulates tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase in vascular endothelial cells. Am. J. Physiol. 277, 150-158 (1999).

5. Madsen, C. T. et al. Biotin starvation causes mitochondrial protein hyperacetylation and partial rescue by the SIRT3-like deacetylase Hst4p. Nat. Comm., 6, e7726 (2015)

6. Wang, J., Wang, X., Fan, X., Chen, P. R. Unleashing the Power of Bond Cleavage Chemistry in Living Systems. ACS Cent. Sci., (2021). DOI: 10.1021/acscentsci.1c00124.