RNA這一高效的生物小分子，依靠其本征的結構功能性，穩定地維持着體内許多重要過程的發生，諸如遺傳信息的輸送和表達、催化反應、結構組成等等。目前對于RNA信息的捕獲，諸多需要通過逆轉錄（RT）和cDNA聚合酶鍊式擴增（PCR）相結合的方式得以實現，但是RT-PCR過程中的随機誤差往往會導緻RNA測序結果的不準确性。因此，實現RNA序列的直接測序一直是新一代測序技術中備受關注的方向。最近，beat365官方网站郭雪峰教授課題組和北京科技大學李立東教授課題組合作，發展了一種基于單分子器件平台的生物單分子電學檢測技術，捕獲到了單個生物蛋白分子（外切酶PNPase）靶向結合底物小分子(RNAs)完整生理過程（圖1），并實現了在單分子水平上區分同質和異質RNA序列單個堿基降解事件的行為，也為RNA的直接測序發展了一種新的技術方向。

圖1. 單分子器件的結構示意圖以及單個堿基降解事件電學檢測捕獲過程

在對單個PNPase與RNA底物分子的結合實驗研究過程中，他們發現PNPase外切酶對于RNA底物的結合穩定性受到溫度、pH以及催化金屬離子的影響，而這些影響主要是源于蛋白分子中結合區域氨基酸的電荷和絡合結構穩定性（圖2）。在穩定的結合條件下，他們進一步觀察到，在單個PNPase外切酶對RNA分子的單堿基降解過程中，活性位點區域R93和R97氨基酸對單個堿基水解事件的發生起到了關鍵性的作用，并通過位點突變實驗進一步證實了這一重要生理現象。随後，他們提出了PNPase外切酶單堿基降解反應的新機制：在PNPase内RNA結合位點的一側，Mg2+通過氫鍵與H2O分子以及RNase PH1結構域内的殘基K492、D486和K494絡合；而在另一側，3 '端初始核苷則通過氫鍵與RNase PH2結構域内的R93和R97殘基配位結合；随後，被活化的配位H2O分子通過氫鍵成功橋連在了Mg2+和磷酸二酯鍵之間；最後，磷酸二酯鍵在被捕獲結合到S437-439的磷酸分子作用下成功水解（圖2）。基于這些原始的發現，并結合對測試數據的大量計算，在對均質和異質RNA序列的測試和數據分析過程後，他們成功區分到序列中不同核苷的結合事件，并繪制出了不同核苷結合事件的指紋圖譜。通過實時和快速的電學檢測，他們将一組具有轉錄組信息（mccA gene）和人工設計的RNA序列分别進行測試分析，依靠大量的指紋圖譜和對單堿基事件的統計計算和分析，成功實現了對序列中單個堿基位點高效鑒别，并分别實現了序列中79.17%（mccA gene）和80%(合成序列）堿基位點的有效區分（圖2）。

圖2. PNPase外切酶單堿基捕獲事件和異質RNA序列的測試

這些結果證明了該電學檢測技術的單分子精度，并顯示了單個外切酶修飾的納米器件在單堿基分辨率下區分不同核苷的能力。這種單分子檢測方法展示了一種獨特的角度來揭示生物酶分子的本征反應機制，進而發展快捷低成本的基因直接測序方法。該工作于2023年2月 1日以“Single-exonuclease nanocircuits reveal the RNA degradation dynamics of PNPase and demonstrate potential for RNA sequencing”為題，在線發表在Nature Communications（Nat. Commun. 14, 552 (2023)）期刊上。

以上工作的第一作者是郭雪峰課題組聯合培養的北京科技大學博士生楊志恒。beat365郭雪峰教授和北京科技大學李立東教授為共同通訊作者。研究得到了國家自然科學基金委、科技部和北京分子科學國家研究中心的聯合資助。

原文鍊接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-36278-6