以對蛋白質進行環化、索烴化、打結等拓撲改造為代表的蛋白質拓撲工程是一種重要的調控蛋白質性質的手段。近年來，基于可基因編碼的蛋白質纏結基元和反應基元的“組裝-反應協同”理念，發展了包括被動模闆、主動模闆、原位串聯反應等多種拓撲蛋白合成方法。由于環化和機械互鎖帶來的構象限制效應，索烴化蛋白質具有抗熱變性、抗化學變性、抗酶解、抗聚集等穩定化特征，具有重要的實用意義。但是目前構建的大部分蛋白質索烴其纏結結構是由額外的纏結基元介導的，産物中往往存在冗餘的序列，其性能也易受額外基元影響，不便于研究和闡明構效關系。因此，單結構域蛋白質索烴的構建至關重要，有助于系統性地探究拓撲對于構效關系的影響，并拓展蛋白質索烴的實際應用。

近期，北京大學張文彬課題組在單結構域蛋白質索烴的設計和合成方面取得重要進展。基于對綠色熒光蛋白（GFP）折疊結構的分析和理解，他們将組成β-桶狀結構的11個β折疊片的連接關系進行重新設計，人為引入纏結關系，設計了單結構域綠色熒光蛋白索烴（圖1），并實現了細胞内和細胞外的可控合成（圖2），發現其相比于野生型具有更好的熱回複性（圖3）。

圖1. 單結構域綠色熒光蛋白索烴的設計。a, 野生型綠色熒光蛋白（PDB：2B3P）的卡通圖、拓撲圖以及基因卡帶。b, 單結構域綠色熒光蛋白索烴的卡通圖、拓撲圖以及基因卡帶。新引入的連接鍊用深紅色和深綠色的加粗線條表示，組成索烴的兩個環分别由紅色和綠色表示。

首先，利用“組裝-反應”協同，作者發展了胞内組裝、胞外環化的兩步合成法，通過綠色熒光蛋白準輪烷中間體實現了綠色熒光蛋白索烴的合成。值得注意的是，胞外環化反應的過程中，準輪烷中間體可以通過分子内反應形成二索烴或分子間反應形成三索烴，二者可以通過體積排阻色譜高效分離（圖2a）。這種設計和構建單結構域索烴的方法還可以拓展到具有類似折疊結構的其他熒光蛋白中。作者将類似的單結構域索烴構建方法進一步應用在來自香菇珊瑚的紅色熒光蛋白（mCherry），來自羽珊瑚的綠色熒光蛋白（mWasabi）和來自于維多利亞水母的黃色熒光蛋白（YPet）中，證實了該方法對于熒光蛋白家族具有一定的普适性，成功構建了單結構域熒光蛋白索烴家族。這種單結構域綠色熒光蛋白索烴的環區還容許通過基因工程的手段模塊化地融合多種目标蛋白質，從而實現融合蛋白索烴的構建（圖2b）。作者還進一步證實，通過應用不同的正交分離型内含肽反應對，可以實現單結構域熒光蛋白索烴的細胞内合成。

圖2. a, 綠色熒光蛋白索烴的合成。b, 融合蛋白索烴的合成。

作者随後探究了索烴化對于蛋白質構效關系的影響。在高溫加熱和冷卻複性之後，綠色熒光蛋白索烴的熒光可以完全恢複，遠優于其環狀對照和線性對照的熒光恢複情況，具有良好的熱回複性。這一性質在融合蛋白索烴中也得以保持（圖3a）。此外，索烴的拓撲結構也為融合蛋白索烴中的功能蛋白提供了一定的構象限制，有效提升了功能蛋白的熱回複性、熱穩定性以及機械穩定性（圖3b）。

圖3. a, 索烴化能夠有效提升蛋白質的熱回複性。b, 索烴化能夠提供額外的構象限制，提升功能蛋白的熱回複性、熱穩定性以及機械穩定性。

綜上所述，作者将綠色熒光蛋白的二級結構基元重新接線，結合兩步合成法，實現了綠色熒光蛋白單結構域索烴的構建。這種方法不僅可以拓展到熒光蛋白家族的其他變體，實現熒光蛋白索烴家族的構建，還可以耐受其他功能蛋白的插入，作為索烴化的模闆實現融合蛋白索烴的構建。這種索烴化的方法更好地實現了不同結構域之間的耦合和協同，在工業酶工程和生物醫藥領域具有廣泛的潛在應用價值。

該研究近期在線發表于Nat. Commun.，beat365官方网站博士生曲志宇為該論文第一作者。beat365官方网站博士生王宇翔，博士後方晶、孫轶斌、劉雅傑、吳文豪也為本工作做出了貢獻。beat365beat365張文彬教授為通訊作者。該工作得到國家自然科學基金、國家重點研發項目、科技部、北京分子科學國家研究中心創新項目的支持。

原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-39233-7