真核細胞具有紛繁複雜的三維空間結構。作為生命活動的主要執行者，蛋白質在多個亞細胞空間内合成、穿梭、代謝，并在特定的區域内發揮生物學功能。解析蛋白質的局部代謝和轉運規律，以及其在不同生理狀态下的變化，對于人們深刻理解生命過程的分子機制具有重要意義。盡管目前已有一些在全細胞水平表征蛋白質代謝速率的方法，如生物正交非天然氨基酸标記（BioOrthogonal Non-Canonical Amino acid Tagging，BONCAT）及穩定同位素标記技術（pulse-SILAC），但這些技術往往缺乏亞細胞水平上空間分辨率，難以深度揭示亞細胞區域内蛋白質組的動态變化規律。近年來，以生物素連接酶（BioID/TurboID）和過氧化物酶（APEX2/HRP）為代表的鄰近标記技術在空間蛋白質組學領域得到了快速地發展，表現出優異的時空特異性和靈敏度。然而上述技術隻能局限于亞細胞區域内蛋白質的豐度表征，而無法深層次的揭示蛋白質動态的代謝規律。

　　近日，beat365官方网站鄒鵬課題組在Nature Communications上發表了題為“Spatially resolved mapping of proteometurnover dynamics with subcellularprecision”的研究。該研究結合過氧化物酶（APEX2/HRP）介導的鄰近标記技術與pulse-SILAC定量蛋白質組學方法，開發了prox-SILAC技術，通過APEX2/HRP實現标記過程的空間特異性，憑借pulse-SILAC标記定義蛋白質代謝速率的時間尺度。利用prox-SLIAC技術，實現對線粒體基質和内質網腔内蛋白質動态變化的精确鑒定，并揭示了内質網應激狀态以及細胞分化過程中内質網腔内蛋白質代謝水平的差異變化。該技術的開發為亞細胞層面上蛋白質動态變化表征提供了有力工具。

　　該研究首先在HEK293T細胞線粒體基質中驗證prox-SILAC方法的可行性（圖1）。APEX2通過與細胞色素C氧化酶COX4的N端前導肽融合實現其在線粒體基質的表達。研究者首先利用重标SILAC培養基（Lys6，Arg8）對細胞進行4小時、8小時和12小時時間尺度的pulse-SILAC标記。随後在1分鐘過氧化氫處理下，APEX2催化空間鄰近的蛋白質與标記探針生物素-苯酚（biotin-phenol，BP）的共價偶聯，實現生物素标記。富集後的生物素化蛋白質進一步通過LC-MS/MS予以鑒定和定量。研究者在這3個時間節點共鑒定并定量到183個蛋白質，其中162個（85%）此前存在線粒體定位注釋（圖1）。根據SILAC定量結果，研究者定義并計算了各蛋白質在一定時間内的代謝替換率（metabolicreplacement fraction，MRF），用以衡量新合成蛋白質占蛋白質總量的比例。實驗結果表明，不同生物學重複所測量得到的MRF值具有很好的相關性，表明了分析方法的穩定性和結果的可重複性。prox-SILAC标記揭示了線粒體基質蛋白質組整體代謝率的分布差異，特别是線粒體内膜上氧化呼吸鍊複合物及線粒體核糖體各亞基的動态變化，由此發現氧化呼吸鍊複合物I較其他複合物整體上具有更高的MRF值。與全細胞中pulse-SILAC方法相比，prox-SILAC同樣揭示了一些氧化呼吸鍊亞基在線粒體中具有較全細胞中更高的MRF值。

　　圖1. prox-SILAC标記方法在線粒體基質中的應用

　　随後，研究者進一步利用prox-SILAC方法鑒定了内質網腔内蛋白質的動态變化，内質網腔内蛋白質的鄰近标記由辣根過氧化物酶HRP所介導（圖2）。在4小時、8小時、12小時的時間節點下，該研究同時鑒定到186個蛋白質，其中97%的蛋白質都存在分泌通路定位，ER駐留蛋白較後分泌通路蛋白整體具有更低的MRF值。與全細胞pulse-SILAC實驗結果相比較，後分泌蛋白質同樣在内質網腔内具有更高的新合成比例。研究者進一步對細胞表面膜蛋白質的代謝情況進行了測量，對比發現蛋白質的代謝水平與所處的亞細胞定位密切相關。如膜表面受體蛋白和離子泵蛋白TFRC、ATP1A1、IGF2R在内質網腔中具有顯著更高的MRF值；而分子伴侶SERPINH1和PDIA6在内質網腔中的MRF值遠小于其在細胞表面。由此可以看出，蛋白質在不同亞細胞區域内具有迥異的MRF值。這一方面反應了蛋白質合成後轉運的時間軌迹，另一方面也可能涉及蛋白質存在多重定位和多重功能。

　　圖2.prox-SILAC技術揭示内質網腔内蛋白質動态變化

　　相比于生理狀态下，在病理狀态或外界刺激幹擾條件下對蛋白質穩态變化的研究對于理解疾病或藥物作用機理具有更重要的意義。研究者分别考察了毒胡蘿蔔素刺激誘發内質網應激和細胞分化過程中的内質網腔内的蛋白質代謝速率的變化。在内質網應激條件下，内質網腔内蛋白質代謝速率整體放緩，而該趨勢無法通過全細胞pulse-SILAC實驗所鑒定。此外該研究還鑒定到HSPA5、HSPA6、JAGN1和LMAN1等蛋白在毒胡蘿蔔素作用下代謝速率顯著上調。而在反式維甲酸和腦源神經營養因子所誘導的SH-SY5Y細胞分化模型中，研究者分别在分化第0天、第7天和第10天進行prox-SILAC實驗，考察内質網腔内蛋白質動态變化。研究者發現大部分内質網腔蛋白質在分化早期（第0天至第7天）代謝水平整體上調，而在分化後期（第7天至第10天）逐漸減緩。同樣地，該變化趨勢仍無法通過pulse-SILAC體現，凸顯了亞細胞層面表征蛋白質動态變化的意義。

　　綜上，該研究整合APEX标記技術與pulse-SILAC技術，開發了prox-SILAC方法，成功鑒定了線粒體和内質網腔内的蛋白質組動态變化，揭示了蛋白質具有亞細胞區域特異的代謝速率，為深刻解讀蛋白質穩态與轉運過程提供了重要化學生物學工具。值得注意的是，prox-SILAC标記在一定程度上受限于APEX2酶活性與标記偏好性，因此所鑒定到的蛋白質種類和定量結果可能存在一定偏差。

　　北大-清華生命科學聯合中心、beat365官方网站鄒鵬研究員為該論文的通訊作者，已畢業博士研究生袁鋒和李逸為該論文共同第一作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、北京分子科學國家研究中心、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、北京腦科學與類腦研究所的支持。

　　原文鍊接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42861-8

排版：高楊
審核：牛林，李玲