2024年5月9日，《化學綜述》（Chemical Reviews）在線發表了beat365官方网站蓋鋒課題組及合作者的題為“Unnatural Amino Acids for Biological Spectroscopy and Microscopy”的長篇邀請綜述文章，回顧了非天然氨基酸探針的關鍵光譜特性及其在生物光譜和成像研究中的應用，同時提出了基于非天然氨基酸的光譜/成像探針的發展思路，展望了這些探針助力解決重要基礎生物科學問題的可能性（例如蛋白質的折疊動力學、構象變化、相互作用、蛋白質局部靜電場、水合、結構-動力學-功能關系等）。

　　蛋白質由20種天然氨基酸構建，通過折疊/組裝和相互作用執行各種各樣的生物功能。因此，蛋白質如何工作以及蛋白質的功能如何在其初級序列中被編碼是生物研究領域中的一個焦點。然而，蛋白質的構象空間多維複雜，其構象變化可能發生在多個時間和空間尺度上，給蛋白質的結構-動力學-功能關系的研究增加了挑戰性。為此，研究者已經發展了多種實驗技術/方法來研究蛋白質的結構-動力學-功能關系，其中，使用非天然氨基酸（UAA）探針獲得蛋白質位點特異性信息是一種有效的研究方法。

　　基于天然氨基酸的光譜信号往往缺乏對蛋白質結構的敏感性和特異性，無法區分蛋白質各個位點的物理或化學性質。研究者将帶有定制光譜特征的分子标記在目标蛋白質的特定位置，然後用光譜技術表征蛋白質。标記分子的分子量越小，結構與替換目标越接近，則目标蛋白質的結構、功能和動力學受到的幹擾越小。UAA不僅具有與天然蛋白質中的氨基酸相似的結構，而且其功能基團具有多樣性，可對蛋白質進行多種修飾。基于UAA的光譜探針位點特異性強、對蛋白質結構擾動小并且靈敏度高。在過去二十年中，基于UAA的光譜探針研究取得了重大進展。這篇綜述重點讨論了基于UAA的振動、熒光、核磁共振和電子順磁共振探針及其光譜/成像應用，并簡要介紹了将UAA标記到蛋白質的常用方法，為讀者提供了詳細的UAA探針使用指南，而且有望推動UAA探針的發展和在生物研究領域的應用。

　　綜述指出，選擇和應用探針時，必須考慮UAA探針對蛋白質天然性質的影響。因此，在應用振動光譜探針時，研究者可以選擇使用同位素取代的無擾動探針，例如酰胺羰基（C=O）和側鍊基團（C-H）被同位素取代的UAA探針。也可以選擇盡可能小的有效振動基團，例如腈基（-CN）和疊氮基（-N₃）等基于2-3個原子的振動基團取代的UAA探針。腈基和疊氮基的振動頻率通常在1800–2400 cm^-1。在這個光譜範圍内，不僅體系的内源信号對探針信号的影響較小，而且上述振動基團的振動對外部環境變化非常敏感，因而已經成功地作為蛋白質探針被廣泛的研究和應用。未來值得推進的研究方向包括：（1）同時應用多個探針從單個實驗中獲得更多的光譜信息，例如可以使用多重探針探測蛋白質變構效應的途徑和動力學；（2）使用合适的探針和時間分辨紅外光譜技術實時監測蛋白質結合/催化反應的局部電場和水合狀态的變化；（3）使用腈基取代的色氨酸或腈基取代的苯丙氨酸直接位點特異性地評估生物電子轉移的動力學；（4）結合探針與電子預共振受激拉曼散射顯微鏡技術，擴展基于色氨酸的探針在生物成像中的應用。

　　在基于UAA的熒光探針方面，由于沒有簡單的理論可以用來定量預測所有相關的光物理性質，包括電子基态和激發态之間的能隙、激發态衰變動力學以及發射光譜和探針的熒光量子産率，發展基于UAA的小分子熒光探針比較困難。因此，研究者們通常首先利用天然熒光氨基酸（如色氨酸）作為起點。例如，蓋鋒課題組發現4-氰基色氨酸具有較高的熒光量子産率（>0.8）和較長的熒光壽命（>12納秒），是一個藍色的UAA熒光探針，預測其将在生物光譜和成像研究方面有重要的應用。此外，作者認為還可以探索基于色氨酸的熒光探針在單分子熒光檢測方面的應用。

　　該工作的第一作者為beat365官方网站的馮冉冉副研究員，第二作者為beat365官方网站的博士生王曼茜，共同通訊作者為beat365官方网站蓋鋒教授和北京師範大學物理學系（現北京師範大學物理與天文學院）張文凱教授。該工作得到了國家自然科學基金委和北京分子科學國家研究中心的資助與支持。

　　論文鍊接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.chemrev.3c00944