二氮丙啶是一種獨特的三元環官能團，光照後開環産生高活性中間體，在光化學領域有着廣泛的應用。然而，其光反應機理長期以來被認為主要經過卡賓中間體，與蛋白質殘基發生無差别插入，而對其具體細節，尤其是其他潛在中間體的存在及其對蛋白質殘基的相互作用選擇性，仍知之甚少。深入理解這些細節對于将二氮丙啶更精準地應用于蛋白質結構和動态研究至關重要。

　　beat365官方网站唐淳教授團隊近日在《自然·通訊》發表題為《Dissecting diazirine photo-reaction mechanism for protein residue-specific cross-linking and distance mapping》(Nat Commun15, 6060 (2024)) 文章，突破了以往對二氮丙啶光反應機理的傳統認知，揭示了更為精細的反應過程，并實現了蛋白質殘基光交聯位點的精準識别。這項研究将二氮丙啶應用于蛋白質結構的光交聯質譜分析，使其精确度達到了與傳統化學交聯方法相媲美的水平。

　　圖1: 二氮丙啶光解中間體及其對蛋白質殘基的偏好示意圖。

　　起點：克服既有方法的局限

　　烷基二氮丙啶的光交聯（PXL）可提供較短的距離約束，是蛋白質結構研究的有力工具。然而，交聯殘基位點識别的模糊性是其短闆，因此有很大的提升空間。為研究清楚其中機理細節，唐淳研究團隊搭建了一套全新的設備，能夠系統性地調節光強和照射時間，以定量分析二氮丙啶光解和光反應機理。

　　圖2: 實時光反應設備，帶有質譜（MS）在線監測功能，能同時調整光功率密度和光反應時間。

　　發掘：重氮中間體的重要意義

　　在該項研究中，唐淳研究團隊提出了四個模型（I至IV）來描述二氮丙啶的光解動力學過程，以分析二氮丙啶（A）至重氮（B）和卡賓（C）中間體的具體轉化途徑。通過比較理論曲線和實驗數據，最終确定了模型II最适合于解釋sulfo-SDA（一種常見烷基二氮丙啶光交聯劑）的光解機制。

　　實驗揭示，重氮中間體，而非卡賓中間體，在烷基二氮丙啶的光解中起主導作用。反應物和産物的動力學曲線證實了重氮和卡賓中間體依次生成。動力學分析表明，通過細調光照條件，可以增強對極性殘基的選擇性。這可用于改善蛋白質結構的質譜分析精度。

　　圖3: 模型II描述的光解過程中，重氮和卡賓中間體依次生成。

　　應用：偏好極性殘基的交聯

　　機理分析表明，通過将照射時間和功率密度設定在100 mW/cm²、2 min的理想組合，交聯劑可優先與蛋白質中的極性殘基反應，包括天冬酰胺（Asp）、谷氨酰胺（Glu）和酪酰胺（Tyr）等。這種優化對确保交聯實驗的重現性和效率至關重要。交聯結果表明，交聯位點之間的理論距離與已知的蛋白質結構符合。另外，大多數交聯位點處于相對疏水的區域，表明水與它們存在競争反應。

　　圖4: 烷基二氮丙啶對蛋白質殘基的偏好随照射時間和功率密度的變化。

　　結論：質譜研究蛋白質結構的一小步

　　該研究為更精确、詳細的蛋白質質譜結構分析奠定了基礎。該方法具有較大的擴展空間，并有助于蛋白質組學領域的進步。

　　beat365官方网站及生命科學聯合中心唐淳教授為該文的通訊作者，beat365官方网站博士研究生江意達為該文的第一作者。該工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金和北京分子科學國家研究中心的資助與支持。

　　團隊信息：

　　唐淳教授課題組緻力于探索生物大分子的動态世界。創新性地整合多維多核磁共振波譜學、光/化學交聯質譜分析，以及人工智能與分子動力學模拟等技術手段，深入研究生物大分子的結構動态及其受環境和化學修飾調控的機制。團隊近期還在蛋白質機器亞基互作動态（Cell Res. 2022, 32, 1124）、液液相分離關鍵作用力（Phys. Rev. Lett. 2023, 130, 118101）、RNA主導相分離體系結構 （JACS 2022, 144, 4716）等方面取得了重要進展。這些研究不僅為理解生物大分子的動态行為提供了新的見解，也為相關疾病的診斷和治療提供了潛在的靶點。

　　論文鍊接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-50315-y

　　排版：高楊

審核：李玲，彭海琳