作為一種天然的生物大分子，蛋白質具有巨大的臨床潛力，可作為多種疾病的治療藥物，如癌症、免疫性疾病和代謝紊亂。與小分子藥物相比，治療性蛋白質具有易編程、功能多樣、高特異性、低毒性和療效優異等優勢。然而，其臨床應用常常受到穩定性差和體内半衰期短等問題的影響。因此，通常将治療性蛋白質與半衰期延長模塊進行生物偶聯，以擴大其治療窗口并改善治療效果。化學拓撲為蛋白質生物偶聯藥物的設計和改造提供了獨特的維度，正逐漸引起研究者們的關注與重視。研究表明，蛋白質生物偶聯藥物的拓撲改造能夠顯著提高其熱穩定性、體内半衰期以及抑瘤效果。

　　近期，為了探究拓撲對蛋白質藥物性能的微妙影響，張文彬課題組以幹擾素（IFN，模型蛋白質藥物）和白蛋白結合結構域（ABD，半衰期延長模塊）為概念驗證基元，通過合理運用諜标簽-諜捕手反應對以及分離型肽介導的定點偶聯策略，利用大腸杆菌直接生物合成了三種氨基酸組成和序列極為相近而化學拓撲結構截然不同的蛋白質拓撲異構體。在蝌蚪形IFN-ABD偶聯物中，位于氨基酸序列鍊中的諜标簽與N端的諜捕手反應生成異肽鍵将兩者之間的IFN環化以增強穩定性，而ABD則位于C端以延長循環時間；進一步通過分離型内含肽的胞内偶聯反應将ABD的C端與諜捕手的N端進行共價偶聯則構建了8字形IFN-ABD偶聯物，而将其中諜标簽的反應位點進行突變使其無法與諜捕手反應生成異肽鍵，僅能形成折疊結構相同的非共價複合物，即得到大環狀IFN-ABD偶聯物。這三個構建均包含相同的組成基元，但是由于不同的區域環化策略而具有不同程度的構象限制。通過正交酶切實驗證明了蝌蚪形、大環狀以及8字形IFN-ABD偶聯物之間的拓撲結構差異。

　　圖1. 三種IFN-ABD偶聯物示意圖：8字形，蝌蚪形和大環狀。

　　研究發現，在非變性條件下，諜标簽與諜捕手的非共價複合物與共價複合物具有類似的結構，各類表征實驗難以區分大環狀和8字形IFN-ABD偶聯物的拓撲結構差異，包括CD光譜、尺寸排阻色譜、受體親和力，甚至半數抑制濃度IC₅₀。隻有在涉及諜标簽突變體和諜捕手所形成的非共價複合物的解折疊時，兩者呈現出顯著的性質差異。例如，8字形IFN-ABD偶聯物表現出更高的熔融溫度和更好的抗聚集能力，這對于在長期儲存期間保持蛋白質藥物的結構完整性和生物活性尤為有益。有趣的是，蝌蚪形IFN-ABD偶聯物的熱穩定性因為共價諜複合物的存在而稍好于大環狀偶聯物，同時又因為未被環化的ABD基元的存在略差于8字形偶聯物。這些區别在動物實驗中越發明顯。首先，在體内半衰期實驗中，相較于野生型（~5.0 h），蝌蚪形偶聯物的半衰期延長至~20.4 h，大環狀和8字形偶聯物則分别延長至~25.6 h和~25.9 h，同時8字形偶聯物的曲線下面積（~52.6 μg·h·mL^-1）遠大于大環狀偶聯物（35.2 μg·h·mL^-1），表明8字形拓撲結構能夠改善吸收、分布或者代謝較慢，最終導緻蛋白質藥物在體内循環中的水平更高，反映出異肽鍵的存在賦予了蛋白質生物偶聯藥物額外的循環穩定性。生物分布實驗也顯示8字形IFN-ABD偶聯物相比于另外兩種拓撲偶聯物在腫瘤處的富集最為明顯，在小鼠腫瘤模型中8字形IFN-ABD偶聯物也表現出最好的抗腫瘤活性。

　　圖2. 三種IFN-ABD偶聯物的拓撲效應探究：熱穩定性（熔融溫度、抗熱聚集能力）以及多種動物實驗（體内半衰期、腫瘤部位熒光衰減以及最後時刻與其他髒器的富集情況對比、小鼠抑瘤實驗）說明8字形偶聯物為三種拓撲異構體中綜合表現最優的候選藥物。

　　這項研究通過探究一系列拓撲蛋白質異構體的性質和功能，總結出如下經驗以更好地發揮拓撲在實際應用中的功能優勢：1）物理相互作用和化學交聯都會增加拓撲的複雜性并對分子施加構象限制，更多更強的有效鍵聯關系意味着更受限的構象空間和更高的熱力學穩定性；2）環化對穩定性的影響依環大小而不同，較小的環預示着更多的構象限制和更高的折疊穩定性；3）共價交聯作為高強度的有效鍵聯關系，在引入折疊結構中時，可大幅提升蛋白質的熱穩定性以及機械/蛋白酶穩定性。通過超越蛋白質主鍊線型結構的認知範式，蛋白質拓撲工程可以兼容并整合其他的生物技術和工程化策略，為提升蛋白質藥物性能提供了一個額外的維度。

　　該研究近期在線發表于Adv. Healthcare Mater.，beat365官方网站博士後劉雅傑為該論文的第一作者。beat365官方网站張文彬教授為論文通訊作者。該工作得到了科技部國家重點研發計劃、國家自然科學基金、北京分子科學國家研究中心的資助。

　　原文鍊接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adhm.202400466