高效的多肽-多肽偶聯反應對于制備蛋白-藥物綴合物、調控蛋白質拓撲結構、生物成像、化學生物學等領域具有重要的意義，并因其可基因編碼的特性而備受關注。目前，研究報道此類連接方法并不太多見，其中分選酶（sortase）或蝶豆粘酶-1（butelase 1）介導的偶聯反應具有較好的底物序列特異性，内含肽（intein）介導的蛋白質連接方法可實現可基因編碼的高效主鍊連接，而轉谷氨酰胺酶（transglutaminase）則可以介導非特異性的側鍊異肽鍵偶聯。近年來，多肽-蛋白質反應對的蓬勃發展為此類工具的發展提供了新的契機。已有諜連接酶（SpyLigase）和探連接酶（SnoopLigase）介導的多肽-多肽偶聯體系見諸報道，但其效率仍有待提高，而其細胞内的應用前景仍有待探索。最近，張文彬課題組發展了獨特的具有無序結構的諜訂書機酶（SpyStapler），可實現諜标簽（SpyTag）和北大标簽（BDTag）在細胞内和細胞外的高效偶聯（圖1）。

圖1. 諜訂書機介導的多肽-多肽偶聯反應

該研究基于對諜标簽-諜捕手（SpyCatcher）複合物的晶體結構分析，将諜捕手從其結構中第二個較為柔性的環區進行拆分，得到北大标簽和諜訂書機酶。研究表明，諜訂書機酶在細胞外和細胞内環境中均可促進諜标簽和北大标簽之間形成異肽鍵，在較溫和的條件下即可達到超過80 %的産率（PBS，4 oC）。該偶聯方法可被用于蛋白質拓撲工程，通過細胞外反應制備四臂的星型彈性蛋白以及環狀的二氫葉酸還原酶。值得注意的是，諜訂書機酶在細胞内也可以高效工作，隻要通過共表達線型的反應性二氫葉酸還原酶和諜訂書機酶，就可以直接在細胞内原位定量實現環化（圖2）。通常，酶需要穩定而有序的折疊結構以實現其功能。諜訂書機酶與之形成鮮明對比。圓二色光譜和核磁共振波譜都證實諜訂書機酶在溶液中完全無序，并不存在一個穩定的折疊結構。隻有在諜标簽和北大标簽同時存在的情況下，它才能形成穩定的二級結構。也正因為它的活性不依賴于預先存在的有序結構，諜訂書機酶可以耐受加熱、反複凍融、化學變性等處理，而不失去其活性。諜訂書機體系的高反應效率和獨特的穩定性為多肽-多肽偶聯以及蛋白質拓撲工程提供了新的工具。

圖2. （a）諜訂書機酶可介導位于柔性鍊中的多肽标簽之間的偶聯，形成四臂星型彈性蛋白；（b）在細胞内共表達反應性DHFR和諜訂書機酶，可實現細胞内蛋白質的原位環化。

該研究近期在線發表于Journal of the American Chemical Society（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.8b08250）。beat365官方网站博士生吳夏泠和劉雅傑為該論文共同第一作者，張文彬研究員為論文通訊作者。香港科技大學的孫飛教授亦參與了該研究。該工作得到國家自然科學基金、863計劃、beat365跨學科醫學種子基金以及吉林大學超分子結構與材料國家重點實驗室開放課題的資助。